層粘連蛋白α2亞鏈在膜性腎病腎小球基膜的異常分布

楊曉青，黃巖杰，呂偉剛，李 靜，畢亮亮，梅曉峰，李金剛

層粘連蛋白α2亞鏈在膜性腎病腎小球基膜的異常分布

楊曉青，黃巖杰，呂偉剛，李 靜，畢亮亮，梅曉峰，李金剛

目的 觀察Ⅳ型膠原和層粘連蛋白(laminin)亞鏈在膜性腎病(membranous nephropathy, MN)腎小球基膜(glomerular basement membrane, GBM)中的異常分布。方法 收集52例MN腎組織，按照Ehrenreich和Churg提出的基于電鏡形態特征的分期方法進行分期，同時收集10例微小病變腎組織作為正常GBM的對照。采用間接免疫熒光法檢測不同分期MN腎組織GBM正常存在的代表性α5(Ⅳ)鏈及laminin α5、β2鏈的分布形態，以及可能異常存在的laminin α2、β1鏈的表達。結果 在微小病變腎組織中α5(Ⅳ)鏈、laminin α5和β2鏈均沿GBM呈連續線狀陽性；laminin α2、β1鏈在GBM中無表達。在Ⅰ期MN腎組織中α5(Ⅳ)鏈、laminin α5和β2鏈均呈連續線狀表達。Ⅱ期MN腎組織中α5(Ⅳ)鏈在連續線狀表達基礎上形成大量釘突；laminin α5、β2鏈表達不規則增多，節段在連續線狀表達基礎上形成釘突。在Ⅲ期MN腎組織中α5(Ⅳ)鏈表達不規則增多，節段雙軌狀表達；laminin α5、β2鏈表達不規則增多，節段雙軌、鏈環狀表達。laminin α2鏈在Ⅰ期MN腎組織GBM未見明顯陽性表達；在Ⅱ期和Ⅲ期MN腎組織GBM呈顆粒狀陽性。laminin β1鏈在各期MN腎組織GBM均未見明顯陽性表達。結論 MN患者GBM增厚不僅源自GBM固有Ⅳ型膠原亞鏈和laminin同種型的表達增多，還有正常僅表達于腎小球系膜區的laminin α2鏈的參與。

膜性腎病；層粘連蛋白α2；腎小球基膜

膜性腎病(membranous nephropathy, MN)是最常見的腎小球疾病，占我國成人原發性腎小球疾病的29.35%[1]、兒童腎活檢總數的7.27%[2]，并逐年增高，在過去的10年中發病率增加了一倍。MN主要病變是腎小球上皮細胞下、基膜外側有免疫復合物沉積，腎小球毛細血管基膜(glomerular basement membrane, GBM)高度均勻一致性增厚，可形成釘突、雙軌、鏈環狀結構。MN GBM增厚源于基膜樣物質在上皮下免疫沉積物之間或周圍沉積，多年來，研究者一直在對沉積的基膜樣物質的成分進行研究，但是隨著人們對細胞外基質成分，尤其是Ⅳ型膠原亞鏈和層粘連蛋白(laminin)同種型認識的深入，目前尚無明確的定論。Ⅳ型膠原和laminin是構成GBM的主要支架，各自形成網絡結構。Ⅳ型膠原至少包括6條α亞鏈，分別命名為α1(Ⅳ)～α6(Ⅳ)鏈[3]。laminin包括15種不同的同種型，由α、β、γ三種不同的多肽鏈亞型組合成三聚體[4]。Ⅳ型膠原和laminin亞鏈在腎小球的分布存在位置特異性。本實驗通過檢測不同分期MN腎組織GBM正常存在的代表性α5(Ⅳ)鏈及laminin α5、β2鏈的表達，以及可能異常存在的laminin α2、β1鏈的表達，以明確MN腎小球基膜增厚形成釘突和鏈環狀結構的組分。

1 材料與方法

1.1 材料 收集2016年1月～6月河南中醫學院第一附屬醫院腎臟病理實驗室經腎活檢明確診斷的特發性MN 52例。按照Ehrenreich和Churg提出的基于電鏡形態特征的分期方法[5]進行分期，其中：Ⅰ期MN 32例，Ⅱ期MN 15例，Ⅲ期MN 5例。同時收集10例腎小球微小病變腎組織作為正常對照GBM。

1.2 方法

1.2.1 腎臟病理檢查 腎穿刺標本經10%中性福爾馬林固定、石蠟包埋，2 μm厚切片，行常規染色(HE、PAS、Masson及PASM-Masson)觀察，間接免疫熒光法檢測PLA2R表達。腎組織冷凍切片厚3 μm，采用直接免疫熒光法檢測常規免疫標記(IgA、IgG、IgM、C3、C4、CIq及纖維蛋白原)及IgG亞型表達。戊二醛固定腎組織常規透射電鏡檢查。

1.2.2 石蠟切片間接免疫熒光法檢測腎組織α5(Ⅳ)鏈及laminin β2鏈表達 腎穿刺組織石蠟切片3 μm厚，常規脫蠟至水，抗原修復(pH 6.0枸櫞酸高溫高壓修復5 min，然后滴加胃蛋白酶消化10 min)，分別滴加鼠抗人單克隆α5(Ⅳ)抗體(瑞典Wieslab公司，稀釋度為1 ∶50)和鼠抗人單克隆laminin β2鏈抗體(美國Hybridoma Bank公司，稀釋度為1 ∶100)，37 ℃孵育2 h，PBS清洗；滴加FITC標記羊抗鼠二抗37 ℃孵育30 min；甘油封片；顯微鏡觀察。每例標本采集10個連續的腎小球，用Image Pro-Plus Software軟件計算平均積分光密度(integrated optical density, IOD)值。

1.2.3 冷凍切片間接免疫熒光法檢測腎組織laminin α2、a5、β1鏈表達 腎穿刺組織5 μm厚切片，常規冷丙酮固定10 min，分別滴加鼠抗人單克隆laminin α2、α5、β1鏈抗體(稀釋度為1 ∶100，美國Chemicon公司)，37 ℃孵育2 h，PBS清洗；滴加FITC標記羊抗鼠二抗37 ℃孵育30 min；甘油封片；顯微鏡觀察。采集每例標本冷凍切片上所有腎小球，用Image Pro-Plus Software 軟件計算IOD值。

2 結果

2.1 α5(Ⅳ)鏈在腎組織GBM中的表達 α5(Ⅳ)鏈在腎小球微小病變腎組織GBM上呈連續線狀陽性。α5(Ⅳ)鏈在Ⅰ～Ⅲ期MN腎組織GBM中的表達分別對應于光鏡下GBM的形態變化，Ⅰ期MN呈連續線狀表達；Ⅱ期MN呈連續線狀表達基礎上形成大量釘突；Ⅲ期MN表達不規則，節段雙軌狀表達(圖1)。半定量分析顯示α5(Ⅳ)鏈在Ⅱ期和Ⅲ期MN腎組織中的表達比微小病變和Ⅰ期MN腎組織明顯增加，差異有顯著性(P<0.01，表1)。

2.2 laminin亞鏈在腎組織GBM中的表達 laminin α5、β2鏈在腎小球微小病變腎組織GBM中均呈連續線狀表達；laminin α2、β1鏈在腎小球微小病變腎組織GBM中無表達。laminin α5、β2鏈在Ⅰ期MN中均呈連續線狀表達；在Ⅱ期MN表達不規則增多，節段在連續線狀表達基礎上形成釘突；在Ⅲ期MN表達亦不規則增多，節段呈雙軌、鏈環狀表達。laminin α2鏈在Ⅰ期MN腎組織GBM未見明顯陽性表達，laminin α2鏈在Ⅱ期和Ⅲ期MN腎組織GBM呈顆粒狀陽性表達。laminin β1鏈在各期MN腎組織GBM中均未見明顯陽性表達(圖2)。半定量分析顯示laminin α5、β2鏈在Ⅱ期和Ⅲ期MN腎組織中的表達比微小病變和Ⅰ期MN腎組織明顯增加，差異有顯著統計學意義(P<0.01，表1)。

ABCDEF

圖1 α5(Ⅳ)鏈在MN腎組織GBM中的表達：A.α5(Ⅳ)鏈在Ⅰ期MN腎組織GBM呈連續線狀表達；B.α5(Ⅳ)鏈在Ⅱ期MN腎組織GBM呈連續線狀表達基礎上形成大量釘突；C.α5(Ⅳ)鏈在Ⅲ期MN腎組織GBM表達不規則，節段雙軌狀表達；D.Ⅰ期MN腎組織GBM呈連續線狀，未見明顯增厚；E.Ⅱ期MN腎組織GBM增厚，可見大量釘突形成；F.Ⅲ期MN腎組織GBM不規則增厚，可見雙軌、鏈環狀結構，免疫熒光和PASM-Masson染色

表1 α5(Ⅳ)鏈和laminin亞鏈在GBM中表達的半定量分析

3 討論

GBM有獨特的Ⅳ型膠原、laminin同種型組分，因而與其它基膜不同，有特征性的電荷和大小選擇特性。MN腎小球毛細血管基膜增厚源于基膜樣物質在上皮下免疫沉積物之間或周圍沉積。本實驗顯示，在MNⅠ期未見GBM固有成分α5(Ⅳ)鏈、laminin α5和β2鏈表達增多；隨著MN分期進展到Ⅱ期、Ⅲ期，釘突、雙軌形成，固有的GBM成分α5(Ⅳ)鏈、laminin α5和β2鏈表達增多，參與釘突和雙軌的形成，與相關的α5(Ⅳ)鏈研究表達結果一致[6]。這些研究結果提示，早期MN免疫復合物在上皮側沉積未能刺激足細胞分泌多的α5(Ⅳ)鏈、laminin α5和β2鏈，隨著免疫復合物沉積的不斷增多，刺激足細胞分泌Ⅳ型膠原和laminin分割和包繞免疫復合物導致GBM增厚、釘突形成。作者長期病理形態學觀察發現，在所有MN病例光鏡下可見到足細胞肥大、電鏡下可見到足細胞足突廣泛融合。

此外，本實驗在進展期MN檢測到正常情況下僅存在于腎小球系膜區的laminin α2鏈在GBM上顆粒狀表達。Setty等[7]的研究檢測了5例特發性MN腎組織laminin α2、α5和β2表達，發現GBM正常組分α5和β2鏈表達的增多，未檢測到laminin α2表達，與本實驗研究結果不一致，可能與兩項研究所用抗體生成廠家不同，針對的抗原表位不同有關。其他幾項有關MN laminin表達的研究[8-9]未做laminin α2表達檢測。Alport綜合征是另一以GBM不規則增厚、撕裂為病理特征的腎臟疾病。Kashtan等[10]研究顯示不論人類，還是犬類、鼠類Alport綜合征均可見正常僅表達于腎小球系膜區的laminin α2鏈(與本研究所用抗體相同)在GBM中表達。

ABCDEF

圖2 laminin亞鏈在MN腎組織GBM中的表達：A.laminin α5鏈在Ⅰ期MN腎組織GBM呈連續線狀表達；B.laminin α5鏈在Ⅱ期MN腎組織GBM不規則顆粒狀表達增多；C.laminin β2鏈在Ⅱ期MN腎組織GBM不規則顆粒狀表達增多，節段在線狀基礎上形成釘突；D.laminin β2鏈在Ⅲ期MN腎組織GBM不規則顆粒狀表達增多，節段呈雙軌、鏈環狀；E.laminin α2鏈在Ⅱ期MN腎組織GBM呈顆粒狀表達；F.laminin β1在MN腎組織GBM陰性，免疫熒光

laminin α2鏈在增厚的GBM沉積的結構和功能意義尚不清楚，但是其增加了MN GBM增厚的結構成分譜。GBM的篩選特性取決于精確的laminin同種型組成，GBM新出現的laminin同種型可能通過改變GBM的孔徑屏障或GBM與足細胞的相互作用在蛋白尿的發生中起作用。Zallocchi等[11]通過對Alport綜合征患者、小鼠模型及CD151基因敲除小鼠的研究提示沉積在GBM的laminin α2鏈可能源自系膜侵入毛細血管袢的絲狀偽足。此外，該實驗組的體內、外實驗結果顯示laminin α2鏈能激活位于GBM外側的足細胞表達局灶黏附激酶(focal adhesion kinase, FAK)[12]，以及下續的足細胞MMP-9、MMP-10和MMP-12表達增加導致GBM損傷。本組前期實驗[13]顯示，以GBM病變為主的MN和Alport綜合征患者腎組織均見腎小球足細胞MMP-9表達增多，可能與異常沉積在GBM的laminin α2鏈刺激足細胞FAK表達有關。

Fischer等[9]的研究顯示MN GBM出現正常僅在胚胎期表達的laminin β1。本實驗在各期MN腎組織中均未檢測到laminin β1在GBM表達。Kashtan等[10]的研究也未在人類Alport綜合征GBM看到laminin β1鏈表達，盡管在犬類、鼠類Alport綜合征GBM可看到局灶laminin β1鏈表達。

綜上所述，MN患者GBM增厚不僅源自GBM固有Ⅳ型膠原亞鏈和laminin同種型的表達增多，還有正常僅表達于腎小球系膜區的laminin α2鏈參與。laminin α2鏈的表達異常不僅豐富了MN患者GBM增厚的結構成分，也可能進一步參與GBM外側足細胞蛋白的表達異常，有待后續進一步深入探討。

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Abnormal distribution of laminin α2 chain in glomerular basement membrane in membranous nephropathy

YANG Xiao-qing, HUANG Yan-jie, Lü Wei-gang, LI Jing, BI Liang-liang, MEI Xiao-feng, LI Jin-gang
(LaboratoryofRenalPathology,theFirstAffiliatedHospitalofHenanUniversityofTraditionalChineseMedicine,Zhengzhou450000,China)

Purpose To study the abnormal distribution of type Ⅳ collagen and laminin chains in glomerular basement membrane (GBM) in membranous nephropathy (MN). Methods 52 cases of MN were collected and staged according to electron microscopic morphological characteristics，and 10 cases of kidney tissues of minimal change disease were used as normal GBM control. Distribution pattern of α5(Ⅳ) chain, laminin α5 and β2 chains, and laminin α2 and β1 chains were detected using immunofluorescence method. Results In minimal change disease, α5(Ⅳ) chain, laminin α5 and β2 chains all showed continuously linear positive expression along GBM, and laminin α2 and β1 chains were negatively expressed in GBM. In stage Ⅰ MN, α5(Ⅳ) chain, laminin α5 and β2 chains all showed continuous linear positive expression along GBM. In stage Ⅱ MN, the expression of α5(Ⅳ) chain was increased and showed abundant spikes on the basis of continuous linear positive staining along GBM, and the expression of laminin α5 and β2 chains was increased，and segmental spikes were seen on the basis of continuous linear positive staining along GBM. In stage Ⅲ MN, the expression of α5(Ⅳ), laminin α5 and β2 chains was also enhanced and segmental double tracks were seen. The expression of laminin α2 chain was negative in GBM in stage Ⅰ MN, but granular positive expression along GBM was seen in stage Ⅱ and stage Ⅲ MN. No positive expression of laminin β1 chain was seen in GBM in different stages in MN. Conclusion The GBM thickness in MN originates not only from intrinsic type Ⅳ collagen chains and laminin chains, but also from laminin α2 chain, which only exist in glomerulus mesangium in normal condition.

membranous nephropathy; laminin α2; glomerular basement membrane

河南省鄭州市普通科技攻關計劃(153PKJGG170)、河南省科技創新杰出青年科技計劃(144100510014)

河南中醫藥大學第一附屬醫院腎臟病理實驗室，鄭州 450000

楊曉青，女，碩士，主治醫師。E-mail: yxqljy@163.com 黃巖杰，女，教授，主任醫師，碩士生導師，通訊作者。 E-mail: huangyanjie69@163.com

時間：2017-6-20 11:18 網絡出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170620.1117.009.html

R 692

A

1001-7399(2017)06-0636-05

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.06.009

接受日期：2017-03-13