MiR-196a與ZG16蛋白在結(jié)直腸癌中的表達意義及相關(guān)性分析

樊鑫鑫 趙青芳 關(guān)露露 劉奇 王茂勛 呂慧芳 陳小兵

MiR-196a與ZG16蛋白在結(jié)直腸癌中的表達意義及相關(guān)性分析

樊鑫鑫 趙青芳 關(guān)露露 劉奇 王茂勛 呂慧芳 陳小兵

目的 通過測定結(jié)直腸癌患者癌組織、癌旁正常組織中miR-196a和ZG16 mRNA的相對表達水平，探討二者與患者臨床病理特征的關(guān)系及二者相關(guān)性。方法 應(yīng)用實時熒光定量PCR，檢測83例結(jié)直腸癌患者癌組織、癌旁正常組織中miR-196a和ZG16 mRNA的相對表達水平，并分析二者相關(guān)性及其與患者臨床病理特征之間的關(guān)系。結(jié)果 癌組織中ZG16 mRNA表達量明顯低于正常組織（t=-27.511，P＜0.001）；癌組織miR-196a表達量明顯高于正常組織（t=9.04，P＜0.001），且二者在癌組織中的表達量呈顯著負相關(guān)（P＜0.001，r=-0.469）；癌組織中miR-196a、ZG16mRNA的表達情況與腫瘤部位、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、有無遠處轉(zhuǎn)移、腫瘤分期明顯相關(guān)（P＜0.05），與性別、年齡、腫瘤大小、分化程度、浸潤深度、CEA水平無關(guān)（P＞0.05）。結(jié)論 兩者可能推動結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展，可能是潛在的病情評估及療效評價的生物標志物；兩者在左右半結(jié)直腸癌中表達量分別有差異，臨床上可能有助于左右半結(jié)直腸癌靶向藥物療效預(yù)測及新的治療靶點的發(fā)現(xiàn)。

結(jié)直腸腫瘤； miR-196a； ZG16蛋白； 臨床病理

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）是世界上最常見的惡性腫瘤之一，死亡率在世界范圍內(nèi)的癌癥相關(guān)死亡率中位居前列。早期診斷在降低其死亡率中扮演著重要角色，生物標志物的研究對于結(jié)直腸癌的早期診斷、個體化治療、發(fā)現(xiàn)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移等具有重要意義。

前期預(yù)實驗提示miR-196a和酶原顆粒蛋白16（zymogen granule protein 16，ZG16蛋白）在結(jié)直腸癌組織中的表達量與癌旁正常組織中的表達量差異顯著［1］，本研究將擴大樣本量對預(yù)實驗結(jié)論進行進一步的驗證，并探討二者與患者臨床病理特征的關(guān)系及兩項指標在癌組織中表達的相關(guān)性。

資料與方法

一、一般資料

選取2016年7月至2016年12月在鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院限期行結(jié)直腸癌手術(shù)治療的患者的癌組織及癌旁5 cm以上的正常組織標本，共計83例，術(shù)前所有患者均未接受放療和化療；組織學(xué)分級采用世界衛(wèi)生組織病理分級標準，術(shù)后分期采用國際抗癌聯(lián)盟（Union for International Cancer Control，UICC）制定的第7版結(jié)直腸癌分期標準；83例患者，平均年齡：（53.45±10.17）歲，一般臨床資料和臨床病理特征詳見表1。本項目受河南省杰出青年基金“MicroRNAs預(yù)測結(jié)直腸癌個體化治療指紋圖譜建立”項目資助，并通過鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院醫(yī)學(xué)研究倫理委員會的批準和許可。

二、主要試劑和儀器

實驗應(yīng)用的主要試劑包括Triozol RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、QR-PCR試劑盒等，主要儀器包括全波長掃描多功能讀數(shù)儀、7500 Fast Dx Real-Time PCR 儀、電泳儀等。具體試劑及生產(chǎn)廠家見表2

三、實驗步驟

（一）組織總RNA提取

標本離體30分鐘內(nèi)分別取出3組癌組織及正常組織放入凍存管后迅速放入液氮中保存，按照美國 Thermo Fisher Scientif i c公司提供的Triozol RNA提取試劑盒的使用說明進行提取57對大腸癌組織及其配對癌旁組織的RNA，并對RNA質(zhì)量檢測：通過凝膠電泳檢測提取總RNA完整性，并應(yīng)用全波長掃描多功能讀數(shù)儀對提取的總RNA的濃度和純度進行鑒定。

表1 83例患者的臨床病理資料

表2 主要實驗試劑和儀器

（二）Real Time PCR

應(yīng)用SYBR ? Green 方法反轉(zhuǎn)錄出cDNA，后選擇SYBR ? Premix Ex Taq TM II 進行ZG16 mRNA和miR-196a的Real Time PCR反應(yīng)，冰上配制PCR反應(yīng)液，兩步法PCR擴增反應(yīng)條件為：預(yù)變性：95 ℃，30 s（1 cycle），PCR反應(yīng)：95 ℃，5 s＋60 ℃，30 s（40 cycle），循環(huán)結(jié)束后，設(shè)置溫度從60 ℃升高到95 ℃獲取熔解曲線。

四、數(shù)據(jù)分析

分別記錄內(nèi)參基因和待測基因的Ct值。根據(jù)熒光定量PCR相對定量統(tǒng)計方法［2］：2-△△Ct表示待測基因相對正常組織的表達量；△△Ct=（Ctl-Ct2）癌組織-（Ctl-Ct2）癌旁正常組織；2-△Ct表示待測基因相對內(nèi)參的表達量，△Ct=（Ctl-Ct2）癌組織/癌旁正常組織；其中：Ctl為待測基因miR-196a/ ZG16mRNA的臨界循環(huán)數(shù)；Ct2：為內(nèi)參基因U6/ HPRT1的臨界循環(huán)數(shù)。

五、統(tǒng)計學(xué)分析

采用 SPSS 21.0軟件、Graphpad prism 7.0軟件分析實驗結(jié)果，組間比較采用 t檢驗，癌組織中miR-196a與ZG16mRNA相對表達量有無相關(guān)性采用Person相關(guān)性分析，其中P值為雙向性檢驗，檢驗水準為 α=0.05，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

圖1 T1～3分別為腫瘤組織，N1～3分別為腫瘤組織對應(yīng)的癌旁正常組織

結(jié) 果

一、檢測提取組織中total RNA 的純度、濃度、完整性

將提取的 83對結(jié)直腸癌癌組織及配對癌旁正常組織中的total RNA，采用 1%瓊脂糖凝膠電泳法檢測所提取total RNA 的完整性。RNA完好提出時，肉眼可觀察到三條條帶，從上到下依次為 28 s、18 s、5 s，其中 28 s 最亮，并且其亮度約是 18 s 條帶亮度的2倍，5 s條帶較模糊，部分甚至不顯示。該電泳結(jié)果說明所提取組織中的 total RNA完整性好，如圖1。同時應(yīng)用全波長掃描式多功能讀數(shù)儀測定A260/A280，值均在1.8～2.0，提示提取total RNA純度、濃度較好（圖1）。

二、57例結(jié)直腸癌患者癌組織中miR-196a及ZG16相對表達量

57例結(jié)直腸癌患者癌組織中miR-196a相對表達水平最高為2.54，最低為0.51，其中74/83（89.16%）患者癌組織中相對表達量高于癌旁正常組織，經(jīng)t檢驗分析癌組織中miR-196a平均表達水平高于正常組織，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001）；癌組織中ZG16 mRNA相對表達水平最高為1.24，最低為0.21，其中83/83（100%）患者癌組織中相對表達量低于癌旁正常組織，經(jīng)t檢驗分析癌組織中ZG16 mRNA平均表達水平低于正常組織，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001）。見圖2，表3。

三、ZG16mRNA與miR-196a相關(guān)性檢測

二者在癌組織中的表達在0.01水平（雙側(cè)）上顯著相關(guān)（P＜0.001）；其中r=-0.469，詳細見表4，圖3。

四、結(jié)直腸癌組織中microRNA-196a和ZG16mRNA的相對表達量與患者臨床病理特征之間的關(guān)系

miR-196a與ZG16mRNA在結(jié)直腸癌癌組織中的表達情況與腫瘤部位、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、有無遠處轉(zhuǎn)移、腫瘤分期具有明顯相關(guān)性，與性別、年齡、腫瘤大小、分化程度、浸潤深度、CEA水平無關(guān)（P＞0.05）。詳細見表5。

討 論

結(jié)直腸癌是我國乃至全世界范圍內(nèi)最常見的消化道惡性腫瘤之一，在我國其發(fā)病率以每年4.2%的速度遞增。雖然學(xué)術(shù)界在近些年來在結(jié)直腸癌的診治方面取得了一定的進展，但患者的長期生存率并沒有明顯改善，早期診斷和治療在降低結(jié)直腸癌病死率中扮演著重要角色。因此，發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用新的有效的生物標志物以提高其早期診出率、探索有效的個體化治療方案、動態(tài)評估病情、及時發(fā)現(xiàn)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移、改善其預(yù)后成為目前研究的熱點。

圖2 癌組織、癌旁正常組織中miR-196a和ZG16mRNA的相對表達量

表3 microRNA-196a 和ZG16mRNA在癌組織和癌旁正常組織中的表達

表4 ZG16 mRNA與miR-196a 在癌組織中相對表達量相關(guān)性分析

圖3 ZG16 mRNA與miR-196a 在癌組織中表達散點圖

ZG16蛋白是1994年Cronshagen U等［3］在篩選大鼠胰腺cDNA表達庫時發(fā)現(xiàn)的一個分子量為16 kDa的可溶性蛋白，主要由肝臟、胰腺、腮腺、消化道分泌，截至目前為止，對其研究大多局限于肝臟和胰腺，對其在結(jié)直腸中表達的研究較少［4-5］。Chen等［1］通對TCGA數(shù)據(jù)庫收集的數(shù)據(jù)行RNA測序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌組織中的ZG16蛋白表達量明顯低于癌旁正常組織；Kim M等［6］研究證實，正常結(jié)直腸組織中可檢測到可溶性蛋白ZG16的表達，在炎性病變（潰瘍性結(jié)腸炎）中可檢測到其高表達，在結(jié)腸癌組織中低表達；Wang等［7］發(fā)現(xiàn)在人類正常結(jié)腸組織中可檢測到ZG16蛋白的表達，而在結(jié)腸腫瘤組織中卻檢測到ZG16 蛋白表達下調(diào)甚至缺失；Chen等［1］經(jīng)Target Scan數(shù)據(jù)庫預(yù)測尋找與ZG16蛋白有關(guān)的miRNAs，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ZG16基因3’UTR端有7個堿基可與miR-196a 5’端構(gòu)成共價鍵，推測ZG16基因表達可能受上游miR-196a的調(diào)控。

MiR-196a是miRNAs重要成員之一，MiRNA是一類長度約為18～22個核苷酸的小內(nèi)源性非編碼RNA，主要是通過調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯，發(fā)揮在靶基因的轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控其表達的作用，其作用類似癌基因或抑癌基因［8-9］。作為miRNAs的重要成員，miR-196a主要是通過調(diào)控下游靶基因的表達量而發(fā)揮功能的，如下調(diào)KRT5、SPRR2C和S100A9等基因的表達量促進食管癌的發(fā)生、發(fā)展［10］；通過下調(diào)HOXA5促進非小細胞肺癌細胞的增殖、擴散和轉(zhuǎn)移［11］；下調(diào)靶基因p27kip1的表達，促進胃癌的發(fā)生，且其高表達能夠促進胃癌的治療耐藥，在乳腺癌中也發(fā)現(xiàn)類似結(jié)果［12-13］；研究發(fā)現(xiàn)，其在婦科腫瘤、頭頸部腫瘤等腫瘤中同樣具有致癌作用［14-17］。

表5 miR-196a、ZG16mRNA與CRC患者臨床病理特征的關(guān)系

本研究中我們采用 qRT-PCR 檢測了結(jié)直腸癌患者癌組織及配對癌旁正常組織中miR-196a和ZG16 mRNA的表達水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與配對的正常組織相比，ZG16 mRNA在癌組織中的表達降低，miR-196a在癌組織中的表達升高，可能促進腫瘤的增殖、擴散，但具體作用機制不明；ZG16 mRNA的表達與miR-196a的表達顯著相關(guān)，兩者之間可能存在調(diào)控關(guān)系；結(jié)直腸癌癌組織中miR-196a與ZG16mRNA的表達量與有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、有無遠處轉(zhuǎn)移及腫瘤分期有關(guān)，與性別、年齡、腫瘤大小、CEA水平、分化程度、浸潤深度無關(guān)；由此可見，兩項指標均與有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、有無遠處轉(zhuǎn)移及分期有關(guān)，提示兩者可能能夠推動結(jié)直腸癌大發(fā)生、發(fā)展，可能是潛在的評估病情及療效評價、預(yù)后預(yù)測的生物標志物。

此外，由于結(jié)直腸癌有多個發(fā)病部位，原發(fā)腫瘤部位在轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌治療決策中的作用，成為近兩年結(jié)直腸癌領(lǐng)域的熱點話題。目前的研究結(jié)論顯示［14-20］，左半結(jié)腸癌與APC、P53、SMAD4等抑癌基因的失活及KRAS基因突變等相關(guān)；而右半結(jié)腸癌則與癌基因的激活、BRAF基因突變、MLH1基因的甲基化失活和MSI陽性表達等相關(guān)。近年來越來越多的研究顯示，轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌的靶向治療療效可能受腫瘤部位和目前已知的這些分子事件共同影響，是否還存在其他分子參與仍有待研究。在本研究中，我們對ZG16 mRNA和miR-196在左右半結(jié)直腸癌中的表達差異也進行了探索，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩者在左右半大腸癌中表達量均有差異，可能與不同部位大腸癌致病機制不同有關(guān)，進一步分析也許會有助于了解左右半的生物學(xué)特征差異，來更好解釋在左右半轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者中的治療療效及預(yù)后等方面差異。

同時本研究也存在一些問題：（1）ZG16蛋白表達測定與ZG16 mRNA測定不完全一致，不能完全根據(jù)mRNA表達量等同于蛋白表達量，可加做Weston Blot測蛋白表達量或者免疫組化測陽性率，對本研究結(jié)論進行驗證；（2）病例數(shù)較少，且僅有組織學(xué)標本相應(yīng)指標的測定，未進行體外細胞實驗驗證；（3）未將兩指標微衛(wèi)星不穩(wěn)定性等可能影響結(jié)直腸癌預(yù)后的因素進行分析，若均納入討論，可能影響本研究的結(jié)論。總之，本研究發(fā)現(xiàn)miR-196a和ZG16mRNA可能是結(jié)直腸癌潛在的生物標志物物，且兩者在癌組織中的表達量呈顯著相關(guān)，二者之間可能存在調(diào)控關(guān)系；由于兩者在左右半大腸癌組織中表達不同，不僅進一步論證了左右半結(jié)直腸癌可能存在不同的發(fā)病機制，且可能有助于左右半結(jié)直腸癌靶向藥物療效預(yù)測和發(fā)現(xiàn)新的治療靶點。

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Expression and their clinical significance of miR-196a and ZG16 in colorectal cancer and their correlations

Fan Xinxin, Zhao Qingfang, Guan Lulu, Liu Qi, Wang Maoxun, Lyu Huifang, Chen Xiaobing. Oncology Department, The Af fi liated Cancer Hospital of Zhengzhou University, Zhengzhou 450000, China Corresponding author: Chen Xiaobing, Email: 2290773710@qq.com

Testing the expression of ZG16 mRNA and miR-196a of colorectal cancer tissue and the adjacent normal tissue to investigate the correlation between the two markers and detect their relationship with clinical pathological features of patients. Methods Quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR) was used to detect the expression level of miR-196a and ZG16 mRNA in cancer tissue and its paired adjacent normal tissue sample from 83 CRC patients. The correlation of the two markers and their relative expression level with clinical-pathological features were also analyzed. Results The realative expression of ZG16 mRNA was signif i cantly lower in CRC tissues compared with adjacent normal tissue samples (t=-27.511, P＜0.001); and the relative expression of miR-196a was signif i cantly higher in cancer tissue compared with adjacent normal tissue samples (t=9.04, P＜0.001), and the relative expression of ZG16 mRNA has a signif i cantly negative correlation with the relative expression of miR-196a (P＜0.001, r=-0.469); The expression of miR-196a is related to tumor location, lymph node metastasis distant metastasis and tumor stages (P＜0.05), and its expression has no relationship with sex, age, the state of CEA, tumor size, differentiation degree or inf i ltration depthof CRC samples (P＞0.05). The same results was found in the expression of ZG16 mRNA. Conclusions Both of miR-196a and ZG16 mRNA may promote the occurrence of colorectal cancer, and suggests that they two may be potential biomarkers for disease and curative effect evaluation. Both of the expression of the two are different in left and right CRC, which may be helpful for individual treatment.

Colorectal neoplasms; MiR-196a; ZG16 protein; Clinical pathology

2017-04-07）

（本文編輯：楊明）

10.3877/cma.j.issn.2095-3224.2017.04.006

河南省杰出青年基金項目（No.144100510008）

450000 鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院腫瘤內(nèi)科

陳小兵，Email：2290773710@qq.com

樊鑫鑫, 趙青芳, 關(guān)露露, 等.MiR-196a與ZG16蛋白在結(jié)直腸癌中的表達意義及相關(guān)性分析[J/CD].中華結(jié)直腸疾病電子雜志, 2017, 6(4): 294-300.