他克莫司對難治性重癥肌無力患者療效以及調節性T細胞的影響

趙旭

他克莫司對難治性重癥肌無力患者療效以及調節性T細胞的影響

趙旭

目的 觀察他克莫司對難治性全身型重癥肌無力的臨床療效、安全性以及治療前后調節性T細胞比例變化。方法 選取2013-09—2015-05于遼寧省海城市中心醫院由他克莫司治療的難治性全身型重癥肌無力患者23例，采用3 mg/d的他克莫司口服治療，觀察記錄治療前以及治療后6個月每個月的MGFA以及MG-ADL評分，并檢測治療前和治療后6個月外周血中CD4+CD25+調節性T細胞比例以及Foxp3的表達水平。結果 患者MGFA以及MG-ADL評分等臨床療效指標接受他克莫司治療后顯著下降，并且隨著治療時間的延長，改善的效果越好。不良反應的發生率為43.5%(10/23)，主要表現為血糖的升高、腎結石、感染、頭痛頭暈、聽力下降和腹瀉。他克莫司治療可以顯著提高外周血CD4+CD25+調節性T細胞比例以及Foxp3的表達水平。結論 他克莫司對于難治性全身型重癥肌無力的臨床治療具有一定的療效，并且可能是通過增加調節性T細胞的比例的機制來發揮作用。

他克莫司；難治性重癥肌無力；MGFA；MG-ADL；調節性T細胞

重癥肌無力(myasthenia gravis，MG)是一種發生在神經肌肉接頭處由AChR抗體介導的自身免疫性疾病[1]。目前主要的治療方法有糖皮質激素、胸腺切除術、免疫抑制劑、血漿置換以及免疫球蛋白等[2-3]，但是仍存在部分患者對上述常規治療方法無應答或者療效不佳，這部分患者被稱為難治性重癥肌無力(intractable myasthenia gravis)[4]。

他克莫司(tacrolimus)，又名FK506，作為免疫抑制劑的一種，目前在國外被報道應用于難治性重癥肌無力[5-7]，但目前國內報道的例數較少。本文通過對我科2013-09—2015-05應用他克莫司治療的難治性全身型重癥肌無力的療效和安全性進行評估，并通過檢測治療前后外周血調節性T細胞的變化以及轉錄因子Foxp3的表達對其進行初步機制的探討。

1 研究對象與方法

1.1 研究對象 選取2013-09—2015-05于我院神經內科就診的23例確診為難治性全身型重癥肌無力患者，其中男6例，女17例；平均年齡(42.1±8.3)歲；所有患者均簽訂知情同意書。納入標準主要參照Drachman等[8]難治性重癥肌無力的界定標準：①年齡18歲以上。②臨床上確診為重癥肌無力患者。③接受過以往常規治療(胸腺切除、免疫抑制劑以及糖皮質)并滿足以下條件之一：治療效果不佳且患者的工作生活受到明顯的影響；依賴于大劑量的糖皮質激素治療并且伴有嚴重的不良反應者；對糖皮質激素治療不耐受者。排除標準：①明顯肝腎功能不全者。②嚴重感染(如HIV感染)、惡性腫瘤者。③對他克莫司藥物過敏。④哺乳或妊娠期以及神經疾病患者。⑤參與其他臨床對照治療實驗。

1.2 治療方案 他克莫司均來源于中國安斯泰來制藥有限公司，劑量參考Tada等人之前的研究[9]，所有納入患者在保持原有治療方案的基礎上，口服3 mg/d他克莫司，早上1 mg，晚上2 mg，且均為飯后至少2 h后服用。所有的患者在治療前以及治療后前半年每個月進行美國MG基金會分型評定(Myasthenia Gravis Foundation of America，MGFA)和MG日常生活量表評分(the myasthenia gravis activities of daily living scale，MG-ADL)[10-11]。

1.3 流式細胞術檢測調節性T細胞亞群 空腹采集納入治療的患者靜脈血2 mL于EDTA抗凝管中，加入等體積的Hank's緩沖液稀釋后緩慢加到人外周血淋巴細胞分離液上層，1 000 g離心20 min之后，將中間的白膜樣淋巴細胞吸出來，將得到的人外周血單個核細胞分別用購自BD公司的CD3+，CD25+，CD4+流式抗體標記，室溫20 min后，根據e-Bioscience公司購買的穿膜打孔試劑盒的操作說明書進行固定，穿膜打孔后，取Foxp3抗體室溫避光孵育1 h，加入Hank's緩沖液洗一遍后重懸細胞，上機檢測，并用Flowjo軟件對所得的各個細胞亞群的比例和表達進行分析。

1.4 統計學處理 應用SPSS 19.0軟件對所有的變量數據結果進行分析操作，結果用(±s)表示，如果所得數據呈正態分布，采用配對t檢驗進行比較，如果數據的分布不符合正態分布，則采用配對Wilcoxon秩和檢驗進行比較不同時間點評分變化。P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 研究結果

2.1 他克莫司治療難治性重癥肌無力的療效觀察 所有23例接受治療的患者都完成了整個治療過程，中途無因不良反應而停藥的患者。他克莫司治療難治性全身重癥肌無力的MGFA以及MG-ADL評分(表1)，與治療前相比，治療后1～6個月的時間點，MGFA和MG-ADL的評分隨著治療時間的延長而逐漸下降，并且各個時間點之間差異具有高度統計學意義(P＜0.001)。

表1 他克莫司治療各個隨訪時間點的療效指標的變化(±s)

表1 他克莫司治療各個隨訪時間點的療效指標的變化(±s)

治療時間 n MGFA P值 MG-ADL P值1個月 23－2.33±3.51＜0.001－2.42±2.45＜0.001 2個月 23－3.68±3.71＜0.001－3.56±2.36＜0.001 3個月 23－3.90±4.03＜0.001－3.89±3.42＜0.001 4個月 23－4.32±3.95＜0.001－4.45±3.75＜0.001 5個月 23－4.67±3.83＜0.001－4.60±3.92＜0.001 6個月 23－5.54±4.65＜0.001－4.87±4.25＜0.001

2.2 他克莫司治療難治性重癥肌無力的不良反應 隨訪6個月的時間內，有10例患者出現不同程度的藥物不良反應，其中有4例在服藥的第4個月出現空腹血糖的升高，3例出現腎結石和輕微的感染，其他3例分別出現不同程度的頭痛頭暈、聽力下降和腹瀉。不良反應的發生率為43.5%(10/23)。

2.3 他克莫司治療難治性重癥肌無力的調節性T細胞比例以及Foxp3表達的變化 他克莫司治療難治性重癥肌無力前后外周血CD4+CD25+調節性T細胞占總CD4+T細胞比例以及Foxp3在CD4+CD25+調節性T細胞的表達水平(表2)，治療6個月后，外周血CD4+CD25+調節性T細胞較治療前顯著增加 (P＜0.05)，Foxp3在CD4+CD25+調節性T細胞的表達水平顯著增加(P＜0.01)。

表2 他克莫司治療難治性重癥肌無力前后調節性T細胞比例及Foxp3表達(±s)

表2 他克莫司治療難治性重癥肌無力前后調節性T細胞比例及Foxp3表達(±s)

組別 治療前 治療后6個月 P值CD4+CD25+/CD4+ 6.52±1.85 8.83±1.42 ＜0.05 Foxp3+/CD4+CD25+ 0.91±0.24 1.23±0.16 ＜0.01

3 討論

他克莫司作為一種免疫抑制劑，目前廣泛用于一些自身免疫病如系統性紅斑狼瘡(SLE)、自身免疫性肝病等的研究[12-13]。自20世紀90年代起，他克莫司被用于重癥肌無力的治療，Minami等[14]報道了利用2～3 mg/d的他克莫司治療全身型重癥肌無力的9例患者，并隨訪5年發現可以明顯增強MG-ADL，并可以將糖皮質激素的治療從24 mg/d減至10.2 mg/d。Nagaishi等[15]用3 mg/d的他克莫司聯合糖皮質激素治療10例重癥肌無力患者，發現7例癥狀得到明顯的改善，并且副作用較低。在本文的研究中，我們采用了3 mg/d的他克莫司治療23例難治性全身型重癥肌無力患者，同時采用了MGFA以及MG-ADL反映臨床的療效。其中MGFA主要反映的是重癥肌無力患者的疲勞耐受性，而MG-ADL主要反映重癥肌無力患者日常生活狀態，我們研究發現，在他克莫司治療1個月后，患者的日常生活就得到了明顯的改善，并且隨著治療的時間延長，改善一直在逐步持續。在納入的23例患者中，其中存在16例聯合潑尼松治療的患者，發現加入他克莫司進行聯合治療后，其中13例患者潑尼松的使用劑量顯著減少，3例患者由于減少了潑尼松的使用劑量導致治療效果不佳，最后重新恢復原有的劑量。我們的研究與之前國外報道的結果相一致，說明他克莫司對于難治性重癥肌無力的臨床癥狀改善具有較好的療效。

重癥肌無力患者中調節性T細胞數量下降以及自身反應性T細胞的大量增殖和激活是其發病的機制之一[16]。糖皮質激素的治療可以顯著地提高調節性T細胞轉錄因子Foxp3 mRNA的表達水平，暗示著糖皮質激素可能是通過促進外周調節性T細胞數量的增加減弱重癥肌無力患者體內自身免疫性反應[17]。有研究發現他克莫司可以通過上調調節性T細胞的比例來治療尋常型銀屑病[18]。在本研究中發現，他克莫司治療6個月后，外周血無論是CD4+CD25+調節性T細胞比例還是轉錄因子Foxp3的表達水平均顯著上調，暗示著他克莫司可能也是通過上調調節性T細胞比例和活性降低自身反應性T細胞的增殖和激活。

綜上所述，他克莫司對于臨床難治性全身型重癥肌無力患者在臨床上具有一定的療效，副作用較小，并且他克莫司可能是通過增加調節性T細胞的比例和數量降低重癥肌無力的外周自身免疫性反應，但是本研究中樣本數量有限，仍然需要擴大樣本進行進一步研究。

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Objective To explore the clinical effects and safety of Tacrolimus in the treatment of refractory systemic type myasthenia gravis and observe the changes of regulatory T cells proportion before and after treatment.Methods 23 patients who were diagnosed with refractory systemic type myasthenia gravis and treated with Tacrolimus at Haicheng Central Hospital，Liaoning Province from September 2013 to May 2015 were selected and given oral Tacrolimus for 3mg/d.Scores of MGFA and MG-ADL were measured before treatment and monthly during the first 6 months after treatment.Meanwhile the expression levels of CD4+CD25+regulatory T cells proportion and Foxp3 in peripheral blood before treatment and during the 6 months after treatment were analyzed.Results The clinical effect indexes of MGFA and MG-ADL were significantly decreased after treatment of Tacrolimus，and with time going，the improvement effects got better.The incidence rate of adverse reaction was 43.5%(10/23)，mainly including blood glucose rise，kidney stone，infection，headache and dizziness，hearing loss and diarrhea.Tacrolimus can significantly increase the expression levels of CD4+CD25+regulatory T cells proportion and Foxp3 in peripheral blood.Conclusion Tacrolimus shows certain curative effects in the clinical treatment of refractory systemic type myasthenia gravis，which is likely to exert the function by means of increasing the regulatory T cells proportion.

Tacorlimus；Refractory myasthenia gravis；MGFA；MG-ADL；Regulatory T cells

2016-12-09)

1005-619X(2017)05-0472-03

10.13517/j.cnki.ccm.2017.05.009

114200 遼寧省海城市中心醫院