人喉鱗狀細胞癌中CMIP的表達及意義

韋黨軍，高潮兵，吳正升

人喉鱗狀細胞癌中CMIP的表達及意義

韋黨軍1,2，高潮兵3，吳正升1

目的 探討CMIP(C-Maf inducing protein)基因在人喉鱗狀細胞癌(laryngeal squamous cell carcinoma, LSCC)和喉息肉組織中的表達及其臨床意義。方法 應用實時熒光定量PCR法檢測28例人LSCC和23例喉息肉組織中CMIP mRNA的表達；應用免疫組化法檢測86例人LSCC和29例喉息肉組織中CMIP蛋白的表達，分析其與LSCC臨床病理特征及其預后的關系。結果 LSCC CMIP mRNA和蛋白表達均顯著高于喉息肉組織；CMIP表達與LSCC淋巴結轉移和臨床分期呈顯著正相關，并且CMIP表達均與LSCC患者無復發生存期(relapse-free survival, RFS)和總生存期(overall survival, OS)密切相關。結論 CMIP可能參與人LSCC的發生、發展，CMIP表達提高可能是LSCC進展和預后不良的潛在標志物。

喉腫瘤；鱗狀細胞癌；CMIP；實時熒光定量PCR；免疫組織化學

喉鱗狀細胞癌(laryngeal squamous cell carcinoma, LSCC)是人喉部最常見的惡性腫瘤，其發病率僅次于肺癌，是呼吸系統第二大惡性腫瘤[1]。盡管近年來LSCC的診療技術有了一定進展，中晚期LSCC患者的預后仍然不令人滿意[2]。另外，一些傳統的判定LSCC患者預后的指標，如臨床TNM分期和腫瘤淋巴結轉移等指標并不能完全準確的評估患者的生存狀況和指導后續治療[3]。因此，探討人LSCC發生、發展背后的分子機制以及相關重要調控因子，有助于發掘并建立新的有效的判定LSCC患者病情進展和預后生物學標志物，乃至將來對LSCC的分子靶向藥物的研發具有重要意義。本文分別使用實時熒光定量PCR和免疫組化法檢測LSCC患者新鮮腫瘤組織和石蠟包埋組織(以喉息肉作為對照)中CMIP(C-Maf inducing protein)的表達及其與患者臨床病理特征及預后的關系，探討CMIP作為LSCC病情進展和患者預后判定的一種新的生物學標志物。目前，關于CMIP在人LSCC的研究國內外尚未見報道。

1 材料與方法

1.1 材料 收集2009～2012年安徽醫科大學第一附屬醫院和太和縣中醫院病理科存檔的86例LSCC和29例喉息肉組織，組織均以10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋。每例病例診斷均經病理證實。按照美國癌癥聯合委員會(AJCC)最新分期標準進行臨床分期。所有病例均獲隨訪，獲得無復發生存期(relapse-free survival, RFS)和總生存期(overall survival, OS)。患者術前均未接受任何放療或化療等治療。另收集2015～2016年安徽醫科大學第一附屬醫院存檔的耳鼻喉手術切除的28例LSCC和23例喉息肉組織，標本離體后立即置入液氮保存。所有病例診斷均經病理證實。

1.2 試劑與方法

1.2.1 實時熒光定量PCR Trizol提取液購自Reagent公司，cDNA合成試劑盒購于Takara公司，Ex Tap PCR反應試劑盒購于Takara公司，PCR引物由上海捷瑞公司合成。首先將收集的LSCC和喉息肉新鮮組織按照試劑說明書進行總RNA提取，cDNA合成和定量PCR檢測。每個樣本分別重復3次，得到擴增曲線和樣本的相對定量Ct值。以標本CMIP的Ct值和內部參照GAPDH的Ct值用2-△△Ct法得到每個樣本CMIP的mRNA相對表達水平。

1.2.2 免疫組化 鼠抗人CMIP單克隆抗體購自Proteintech公司(工作濃度1 ∶100)，采用免疫組化MaxVision法染色，即用型免疫組化試劑盒及DAB顯色劑均購自福州邁新公司，具體操作按說明書染色步驟進行。以PBS緩沖液代替一抗作陰性對照，用已知陽性標本作為陽性對照。

1.3 結果判定 CMIP染色以細胞質出現明顯的黃色顆粒視為陽性著色，染色標準綜合陽性細胞率及染色強度進行評估，判斷表達強度：0分為陰性(-)，1～2分為弱陽性(1+)，3～4分為中度陽性(2+)，5～6分為強陽性(3+)。陰性和弱陽性視為低表達，中度和強陽性視為高表達。

2 結果

2.1 CMIP在人LSCC和喉息肉組織中的表達 在新鮮樣本中，28例LSCC的CMIP mRNA表達量為3.05±1.25，23例喉息肉組織為1.44±0.52，兩者之間差異有統計學意義(P<0.01)(圖1)。而CMIP蛋白陽性信號呈黃色顆粒狀，主要定位于鱗狀細胞癌的細胞質，正常鱗狀上皮有少量表達(圖2)。86例石蠟包埋LSCC組織中CMIP高表達率為52.3%，29例喉息肉組織高表達率為27.6%，兩者之間差異有統計學意義(P<0.01，表1)。

圖1 喉息肉和喉鱗狀細胞癌組織中CMIP mRNA的表達

表1 CMIP在人喉鱗狀細胞癌和喉息肉中的表達[n(%)]

*P=0.021

AB

圖2 CMIP蛋白在喉息肉組織(A)中呈低表達，在喉鱗狀細胞癌組織(B)中呈高表達，MaxVision法

2.2 CMIP表達與LSCC臨床病理特征的關系 CMIP表達與LSCC淋巴結轉移和臨床分期呈顯著正相關(P<0.05；P<0.01)，與患者年齡、性別、腫瘤位置和組織學分級均無顯著相關性(P>0.01，表2)。

表2 CMIP表達與人喉鱗狀細胞癌臨床病理特征的關系[n(%)]

2.3 CMIP表達與LSCC患者預后的關系 為探討CMIP表達與LSCC患者預后的關系，本實驗采用Kaplan-Meier曲線法和Log-rank檢驗對CMIP蛋白表達及LSCC患者RFS和OS關系進行單因素生存分析。86例具有完整隨訪資料的LSCC患者，CMIP蛋白表達均與患者RFS和OS密切相關(P均<0.01，圖3)。

圖3 喉鱗狀細胞癌組織中CMIP蛋白表達與患者無復發生存率(A)和總生存率(B)的關系

3 討論

喉癌是臨床耳鼻咽喉頭頸外科常見的腫瘤之一，好發于中老年男性，其具體病因尚不十分清楚，可能與患者吸煙、病毒感染和飲酒過多等多種因素有關。近年來，隨著我國城市大建設和城鎮工業化的影響，大氣污染如霧霾等日益加重，可能也是引起喉癌發病率升高的原因之一[4-6]。目前，臨床喉癌的治療主要采取以手術治療為主的綜合治療，包括手術治療、化療、放療和免疫治療等。然而，每種治療均有其優缺點，對于喉癌患者特別是中晚期患者的治療效果難以達到滿意的效果。近年來，隨著“個體化治療”和“精準治療”等理念的提出，迫切需要開發新的有效的腫瘤生物標志物和藥物靶點為不同患者提供最合適的治療策略[7-8]。因此，認識腫瘤發生、發展和侵襲轉移等分子機制，從中發掘重要的調控因子對監測腫瘤病情發展、指導治療和建立藥物靶點有著重要意義。

LSCC是臨床實踐中喉癌最主要的組織學類型，目前大多數喉癌研究均以其為研究對象，陸續發現了一些LSCC相關的癌基因和抑癌基因。Gao等[9]采用免疫組化法檢測76例LSCC和26例喉息肉組織中ARTN基因及其受體GFRα1表達，發現LSCC中ARTN和GFRα1表達顯著高于喉息肉組織，并且與腫瘤臨床分期和患者預后密切相關。Zhuang等[10]研究發現LSCC組織中CCAT1表達顯著高于癌旁組織黏膜組織，并且與腫瘤組織學分級和臨床分期密切相關，進一步體外研究發現，高表達CCAT1能夠促進LSCC細胞Hep-2的增殖、侵襲和轉移，提示CCAT1可能在LSCC發生、發展過程中發揮癌基因角色。孫玉滿等[11]應用免疫組化SP法檢測85例LSCC及癌旁切緣組織中p53、p21和Cdk1/p34cdc2蛋白表達，發現p53、p21和Cdk1/p34cdc2蛋白在LSCC發生、發展中可能起重要作用，癌旁切緣組織中p53、p21和Cdk1/p34cdc2過表達與LSCC局部復發密切相關，Ge等[12]研究發現miR-300在LSCC組織中表達較癌旁正常組織顯著下調，并且過表達miR-300可以顯著抑制Hep-2細胞的增殖和侵襲，提示miR-300在LSCC進展中發揮抑癌基因角色。

CMIP是一種銜接蛋白，具有兩種亞型：一種亞型是短蛋白，參與多種信號通路，并且在微小病變型腎小球腎炎的發病中發揮重要作用[13-14]；另一種亞型是長蛋白，其功能目前尚不清楚[15-16]。CMIP在人LSCC中角色尚未見報道。本實驗首先使用兩種技術檢測LSCC組織和良性喉息肉組織中CMIP蛋白和mRNA的表達，發現惡性腫瘤組織中CMIP蛋白和mRNA表達均較良性病變組織顯著提高。進一步通過臨床病理特征分析發現，CMIP表達與腫瘤淋巴結轉移和臨床分期呈正相關，并且與LSCC患者RFS和OS呈負相關，提示CMIP在LSCC發生、發展中可能發揮癌基因角色。

綜上所述，本實驗通過檢測臨床LSCC組織和喉息肉組織樣本中CMIP的表達，發現CMIP表達量與患者病情進展和術后生存期密切相關，提示CMIP可能參與LSCC發生、發展，其表達量可能是預測病情進展和患者預后的生物學指標。

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Clinical significance of CMIP expression in human laryngeal squamous cell carcinoma

WEI Dang-jun1,2, GAO Chao-bing3, WU Zheng-sheng1
(1DepartmentofPathology,AnhuiMedicalUniversity,Hefei230032,China;2DepartmentofOtorhinolaryngology,TaiheHospitalofTraditionalChineseMedicine,Fuyang236600,China;3DepartmentofOtorhinolaryngology,HeadandNeckSurgery,FirstAffiliatedHospitalofAnhuiMedicalUniversity,Hefei230032,China)

Purpose To investigate the expression of C-Maf inducing protein(CMIP) in human laryngeal squamous cell carcinoma and polyps tissues, and to analyze their association with clinicopathological parameters and survival of patients with laryngeal squamous cell carcinoma. Methods Real-time PCR assay was used to detect the expression of CMIP mRNA in 28 cases of laryngeal squamous cell carcinoma and 23 cases of polyp fresh tissue specimen. Immunohistochemical staining was used to detect the expression of CMIP in 86 cases of formalin-fixed and parrffin-embedded laryngeal squamous cell carcinoma and 29 cases of polyp tissue specimens. The clinicopathological and prognostic significance of CMIP expression was investigated in laryngeal squamous cell carcinoma. Results The expression of CMIP mRNA and protein was both significantly increased in laryngeal squamous cell carcinoma compared with polyp tissue specimens. The expression of CMIP was significantly associated with tumor lymph node metastasis and late clinical stage of laryngeal squamous cell carcinoma. Furthermore, the expression of CMIP was significantly correlated with poor relapse-free survival and overall survival in laryngeal squamous cell carcinoma. Conclusion CMIP might play an important role in the development and progression of laryngeal squamous cell carcinoma and increased expression of CMIP might imply disease progression and poor outcome in patient with laryngeal squamous cell carcinoma.

laryngeal neoplasms; squamous cell carcinoma; C-Maf inducing protein; Real-time PCR; immunohistochemistry

安徽省學術和技術帶頭人及后備人選科研基金資助項目(2016H074)、安徽省高校優秀青年人才支持計劃重點項目(gxyqZD2016046)

1安徽醫科大學病理學教研室，合肥 2300322安徽省阜陽市太和縣中醫院耳鼻喉科，阜陽 2366003安徽醫科大學第一附屬醫院耳鼻喉科，合肥 230032

韋黨軍，男，碩士研究生。Tel: (0551)62922025，E-mail: 13966591297@163.com 吳正升，男，博士，教授，通訊作者。E-mail: woozson@126.com

時間：2017-6-20 11:18 網絡出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170620.1117.012.html

R 739.6

A

1001-7399(2017)06-0649-04

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.06.012

接受日期：2017-02-14