生理實驗教學中開展大鼠腦片制備及觀察實驗的實踐

周 辰, 高 珊,2, 魏 軍, 畢 群

(1. 北京大學生命科學學院 生物學國家級實驗教學示范中心, 北京 100871；2. 山東省醫學科學院 基礎醫學研究所, 山東 濟南 250062)

生理實驗教學中開展大鼠腦片制備及觀察實驗的實踐

周 辰1, 高 珊1,2, 魏 軍1, 畢 群1

(1. 北京大學生命科學學院 生物學國家級實驗教學示范中心, 北京 100871；2. 山東省醫學科學院 基礎醫學研究所, 山東 濟南 250062)

急性腦片是神經生物學研究中的重要材料,開展急性腦片制備的實驗,有助于接觸科學前沿、增加學習興趣、提高教學質量。北京大學生理學實驗課程組從2013年開始,嘗試在選做實驗部分開展大鼠急性腦片制備與觀察的內容,至今已有112人完成了實驗,取得了比較好的反饋。積累的教學經驗為進一步開展與腦片相關的擴展實驗提供了較好的基礎,并且也為教學改革提供了思路和方向。

生理實驗； 急性腦片； 振動切片

生理學實驗是重要的基礎課程之一,北京大學生命科學學院的教學計劃中,生理學實驗屬于主干基礎課,并與生理學理論課綁定,因此是必修課程。生理學實驗的一個重要特點是經典實驗比較多,主要的教學意義在于對理論課教學的輔助作用,同時鍛煉學生的動手能力、合作能力、邏輯思維能力以及報告寫作能力等。然而經典的實驗內容在當前的科學研究中缺少實際應用,并且實驗方法單一,不容易調動學生的學習積極性,不利于課程教學目的的實現。當前科學研究,特別是神經生物學研究中經常進行一些與生理學相關性較高的功能性實驗。開展類似的實驗教學,能夠提高學生的學習興趣,并且對科學前沿有一定的認識,獲得更好的教學效果。但這些實驗,如雙光子在體成像通常需要使用大型儀器,不具備本科生教學的條件。此外有些實驗操作復雜,例如膜片鉗記錄等,需要較長時間的練習,難以在一兩次課程中掌握。這些都限制了在生理學實驗課上開展科研中常用實驗技術的內容。

離體腦片是神經生物學中常用的材料,特別是在電生理學實驗中,離體腦片可以保持內部突觸聯系和神經回路,是非常重要的研究樣本。在儀器方面,主要設備是振動切片機,國產產品價格相對較低。制備完成后的觀察需使用正置顯微鏡及紅外CCD,由于通過電腦屏幕顯示圖像,因此可以允許較多的學生進行觀察。在操作方面,腦片制備步驟明確,難度適中,對初學者要求有細心、耐心和較好的合作,既可以鍛煉培養學生的實驗計劃性、細致性、合作意識及實際動手能力,在實驗結果上又有很大可能在腦片中觀察到存活的神經元,收到有效的教學結果,對學生產生正向激勵作用。因此，離體腦片制備及觀察實驗在本科生教學中開展,提供了一個能夠了解科研常用方法的內容。

1 實驗材料與試劑

使用出生后14天的SD大鼠乳鼠進行腦片制備。解剖液配方：NaCl,64 mM；NaHCO3,25 mM；CaCl2,0.5 mM；MgSO4,3.3 mM；KCl,2.5 mM；Na2HPO4,1.25 mM；葡萄糖,10 mM；蔗糖,120 mM。人工腦脊液(aCSF)配方：NaCl,125 mM；NaHCO3,25 mM；CaCl2,2 mM；MgSO4,1 mM；KCl,3 mM；Na2HPO4,1.25 mM；葡萄糖,10 mM。麻醉劑：烏來糖(氨基甲酸乙酯),20%(質量體積百分比)。

2 實驗儀器

振動切片機KD-400型(浙江金華科爾諾電子科技有限公司)；正置顯微鏡BX51WI(奧林巴斯(中國)有限公司)；紅外CCD IR-1000(美國DAGE-MTI公司)；正置顯微鏡X-Y移動平臺BX-51-XY(上海思巖實業有限公司)。

3 實驗方法

3.1 實驗前準備

由于腦片制備所需的溶液需提前配制,并用氧氣飽和1 h以上,因此由教師在課前準備。按照200 mL/人的數量配制解剖液,按照100 mL/人的數量配制aCSF,提前將部分解剖液凍成冰塊。切片所需刀片為雙面剃須刀片,分為2部分后用100%乙醇浸泡去除油脂。上課前1 h將解剖液放入4 ℃的水浴或冰中預冷,aCSF放置在室溫下,2種溶液均通入95%氧氣和/5%二氧化碳混合氣進行飽和。

3.2 取腦

在手術前準備2個10 cm直徑的塑料皿,分別倒入預冷的充氧解剖液,并放入解剖液制成冰塊維持溫度。從乙醇中取出刀片固定在刀片架上,刀片與水平面成15～20°角。振動切片機腦片槽中加入預冷的

充氧解剖液,放入解剖液制成的冰塊并通入氧氣/二氧化碳混合氣。取出生后14 d的SD大鼠乳鼠,腹腔注射0.5 mL麻醉劑,以能夠快速麻醉為準。小心剪去頭皮,暴露顱骨,用剪刀快速剪下頭部,放入塑料皿中的預冷解剖液內,沿矢狀縫剪開并剝離頭骨,使用不銹鋼勺挖出完整大腦,放入另一個塑料皿的預冷解剖液中。

3.3 切片

取出的大腦背側向上放置,用刀片垂直切去小腦和前腦,并放在刀片上離開液體,用濾紙小心吸干周圍水分,在切片臺上滴加502膠水,前腦切斷面向下固定在切片臺上?？焖俅蹈赡z水,粘牢后將切片臺固定在切片槽中,保證大腦浸入預冷的充氧解剖液。

啟動振動切片機,以較低的前進速度和較高的振動速度進行切片,厚度300～400 μm。每個切片完成后可用毛筆將其與全腦分離,并用粗口塑料吸管吸出切下的腦片放入充氧的室溫aCSF中孵育1 h以上。

3.4 觀察

腦片孵育完成后,用吸管轉移到灌流槽中,放置在正置顯微鏡下觀察,通過紅外CCD成像,顯示腦內結構及神經元形態。

4 結果

在教師示范后,學生自行完成大鼠腦片制備,在高倍鏡下可以觀察到腦內神經元。由于紅外成像的分辨率較差,因此神經元與周圍背景的區分比較模糊。在海馬區可見密集排列的錐體細胞(見圖1),其他區域也可觀察到神經元數量較多的區域(見圖2),在這些區域中能夠觀察到的神經元多為類似三角形的不規則形狀。同樣也能夠看到已經死亡的神經細胞(見圖3),其表現為膨脹變圓,在活性較差的腦片中此類細胞數量較多。

圖1 海馬細胞層

圖2 皮層區域的神經元

圖3 皮層區域的死細胞

除神經細胞外,腦中的膠質細胞,例如星形膠質細胞等不能清楚地看到。但在某些位置可以看到細長的管狀結構,其中還有兩面凹的圓餅狀細胞,提示該結構可能是腦內的微血管(見圖4)。

圖4 疑似的微血管結構

5 教學經驗

腦片實驗所需準備的物品較多而零散,充氧需要提前至少1 h進行,制作解剖液冰塊需要提前1 d。由于進行實驗的學生較多,因此切片機、孵育腦片的容器數量也較多,每組切片浴槽液、孵育液等要分別充氧飽和。這些都要求教師在課前進行細致的準備,擺放條理整齊,才能保證實驗順利進行。

由于神經元對于缺氧缺血非常敏感,取腦后到將切下的腦片放入孵育液的時間間隔越短越好,因此腦片實驗需要操作者對整個流程有全局的掌握和充分的準備,同時對熟練度有較高要求。教師在課前發放講義,在示教過程中介紹詳細的操作步驟和注意事項,指出腦組織操作的時間特殊性,強調要對全程操作的步驟心中有數方可實施,同組實驗者要做好配合,切忌匆忙上手,做一步考慮一步。

學生在實驗課上是初次操作,很難做到快速、準確地完成,因此學生制備的腦片活性可能并不理想。對此應向學生明確實驗目的主要是了解制備過程并實際動手嘗試,避免學生由于無法在課上制備活性較好的腦片而產生挫敗感。此外,腦片制備的難度適中,在實際教學中,絕大多數學生的腦片中都能夠找到存活的神經元,可以進行后續的觀察,獲得所需的結果。

學生操作過程中除了不熟練導致速度較慢以外,最大的失敗因素是切片時腦固定不牢,切片厚度不穩定,甚至造成腦切塊與腦片臺脫離,而無法進行切片。國產切片機KD-400型配備的腦片臺為不銹鋼材質,與腦切塊的黏合性很差,因此在實際使用中另行設計制作了塑料材質的腦片臺,固定和切片成功率得到了提高。但塑料材質的問題是如不及時清理殘余的502膠水,后期將很難刮除,最終造成腦片臺無法使用。為此,目前教學條件下實驗前要求學生切片結束及時清理,避免長期積存無法清理,影響使用。后續將參考其他切片機尋找更合適的材料制作腦片臺。

6 后續實驗設計

腦片制備是神經生物學的基本技術,在此基礎上可以開展多種實驗。實驗處理可以在切片前對活體動物操作,或者在切片后對離體腦片施加。例如對動物進行缺血處理后,制備腦片觀察其中神經元的死亡情況[1]；也可以在動物發生驚厥[2]或經低氧預處理[3]后研究其電生理學等性質的變化。利用離體腦片可以建立多種損傷模型,例如氧糖剝奪模擬的缺血模型[4]。建立這類模型后進一步研究神經元電生理學特性[5]或者蛋白質修飾[6]等方面的現象。腦片也可以進行長時間培養,從而研究各種藥物和處理的慢性作[7-8]。

腦片的主要用途是進行電生理學記錄及光學成像等。厚度在300～400 μm范圍內的腦片是進行電生理學記錄的重要材料[9],特別是在突觸可塑性的研究中[10],能夠充分發揮腦片保持了完整神經聯系的優點,這在一些藥理學研究中也有著重要的應用[11]。振動切片機也可以制備較薄的腦片,厚度在100 μm左右,這種厚度的腦片可以進行尼式染色等標記進行光學觀察,用于神經元存活及形態等方面的研究。使用熒光染料及熒光顯微鏡等設備,根據染料的不同,可以觀察并記錄腦片內的神經元、樹突脊等形態和鈣信號等現象[12-13]。

雖然在腦片上可以完成的科學實驗種類很多,但是通常都需要大型設備,例如膜片鉗系統、熒光顯微鏡或雙光子顯微鏡等。另外膜片鉗記錄等實驗操作復雜,比較難以在本科生實驗教學中開展?？梢钥紤]在腦片制備實驗的基礎上,進一步選修一些高級實驗,例如電生理學記錄或熒光成像觀察等,豐富教學體系。

7 結語

基礎實驗的教學工作除了通過經典實驗提高學生對理論知識的理解,還需要與時俱進,跟上科學前沿的發展。在科研工作飛速發展的背景下,生理學實驗教學與科研方法的距離越來越遠,對于教學工作也造成了很大的困擾。為了提高教學質量和學習興趣,必須不斷改革實驗內容,這樣才能在本科教育中繼續發揮作用。離體腦片制備及觀察實驗的開展,是一個有益的嘗試,并且也取得了較好的反饋,因此將繼續進行探索,增加參加實驗的人數并擴展實驗內容。

致謝:感謝柴真教授在講授生理學理論課的同時指導我們開展教學和實驗改革,對生理學實驗課的建設和發展提供了重要的支持。

References)

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Practice on preparation of rat brain slices and its observation experiment in physiological experimental teaching

Zhou Chen1, Gao Shan1,2, Wei Jun1, Bi Qun1

(1. National Experimental Teaching Demonstration Center for Biology,School of Life Science,Peking University, Beijing 100871,China; 2. Institute of Basic Medicine,Shandong Academy of Medical Sciences,Jinan 250062,China)

Acute brain slices are important materials in the neuroscience studies. The experiment of the preparation of the acute brain slices is helpful to contact the scientific frontier,increase the interest in learning and improve the teaching quality. From 2013,the Physiological Experiment course group at Peking University tried to select the experimental part to carry out the preparation and observation of rat brain slices. So far,112 students have completed the experiment,and the good feedback is achieved. The accumulated teaching experience provides a good basis for the further development of brain slice related experiments,and also provides the idea and direction for the teaching reform.

physiological experiment; acute brain slice; vibration slicing

10.16791/j.cnki.sjg.2017.07.045

2017-01-10

國家自然科學基金基礎科學人才培養基金項目(J1310033)

周辰(1975—),男,江蘇無錫,博士,工程師,研究方向為神經生物學和電生理學.

E-mail：zezhou@sina.com

G642.0; Q4-33

A

1002-4956(2017)07-0174-04