miRNA-210在癡呆中的調(diào)控作用及機(jī)制

黃菁菁，燕蘭云，余真，馮美江，魯翔

(1.南京醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院老年科，江蘇 南京 210011；2.南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，江蘇 南京 210029； 3.南京醫(yī)科大學(xué)附屬逸夫醫(yī)院老年科，江蘇 南京 211166)

miRNA-210在癡呆中的調(diào)控作用及機(jī)制

黃菁菁1，燕蘭云2，余真1，馮美江1，魯翔3

(1.南京醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院老年科，江蘇 南京 210011；2.南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，江蘇 南京 210029； 3.南京醫(yī)科大學(xué)附屬逸夫醫(yī)院老年科，江蘇 南京 211166)

目的：觀察miRNA-210在癡呆或嚴(yán)重認(rèn)知功能障礙老年患者血漿中的表達(dá)變化，探討miRNA-210對老年癡呆患者的臨床意義。方法：利用miRNA芯片檢測老年患者(有無癡呆或嚴(yán)重認(rèn)知功能障礙)血漿中miRNA-210水平變化。結(jié)果：癡呆或嚴(yán)重認(rèn)知功能障礙的老年患者血漿中miRNA-210的表達(dá)水平明顯高于無癡呆或嚴(yán)重認(rèn)知功能障礙的老年患者。結(jié)論：miRNA-210在癡呆或嚴(yán)重認(rèn)知功能障礙的發(fā)生發(fā)展過程中可能起著重要調(diào)控作用，可進(jìn)一步深入研究其內(nèi)在機(jī)制。

癡呆；嚴(yán)重認(rèn)知功能障礙；miRNA

近些年來隨著人口老齡化的加劇，老年癡呆的發(fā)病率逐年遞增[1]。該病起病隱襲，進(jìn)展緩慢，早期癥狀輕微，且缺乏相關(guān)診斷標(biāo)志物。其中血管性癡呆占老年癡呆的80%以上，與腦組織的缺血缺氧密切相關(guān)。而隨著對于miRNA的研究越來越深入，我們發(fā)現(xiàn)miRNA參與調(diào)節(jié)了生長發(fā)育、細(xì)胞增殖、分化、信號通路、新陳代謝和凋亡[2]，其中miR-210與缺血性卒中的關(guān)系也逐漸明朗。本項研究旨在研究miRNA-210在癡呆或嚴(yán)重認(rèn)知功能障礙老年患者血漿中的表達(dá)變化，為研究老年癡呆的分子調(diào)控機(jī)制提供實驗依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對象

1.1.1 實驗組 選取2015年1月至2015年12月期間在我院老年專科門診診斷(診斷標(biāo)準(zhǔn)參照2011年中國癡呆與認(rèn)知障礙診治指南[3])為癡呆或嚴(yán)重認(rèn)知功能障礙的65歲以上男性45例。入選時符合納入實驗組要求。中途退出實驗3例，最終完成實驗人數(shù)42例。年齡65～96歲，平均年齡(83.2±7.9) 歲。隨訪2年，每年收集1次實驗組血漿(分別為實驗組1年和實驗組2年)，所有標(biāo)本-80 ℃保存。研究對象均了解和同意該項研究并簽署同意書。

1.1.2 對照組 選取2015年1月至2015年12月期間在本院老年專科門診就診，排除癡呆或嚴(yán)重認(rèn)知功能障礙診斷的65歲以上男性45例。入選時符合納入對照組要求。中途退出實驗1例，最終完成實驗人數(shù)44例。年齡66～92歲，平均年齡(78.8±8.2) 歲。隨訪2年，收集1次對照組血漿，所有標(biāo)本-80 ℃保存。研究對象均了解和同意該項研究并簽署同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 一般資料 包括姓名、年齡、婚姻狀況、教育年數(shù)、既往史、家族史、MR檢查。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)大血管性梗塞或腦出血，短暫性腦缺血發(fā)作病史;(2)帕金森病等神經(jīng)變性或退行性疾病;(3)其他可能影響認(rèn)知的神經(jīng)系統(tǒng)疾病、腫瘤等; (4)聽力嚴(yán)重下降影響交流或認(rèn)知測試; (5)不能接受磁共振成像檢查。

1.2.2 認(rèn)知功能測試 主要包括評價總體認(rèn)知水平的簡易智能量表(mini-mental state examination，MMSE) 。≥25分為認(rèn)知正常；14～24分為輕度認(rèn)知功能障礙；≤13分為癡呆或嚴(yán)重認(rèn)知功能障礙。

1.2.3 實驗方法 (1)主要儀器：美國ABI ViiA7實時定量PCR儀。(2)主要試劑：miRNA提取分離試劑盒來自GeneMark公司。反轉(zhuǎn)錄試劑盒、用于熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(real time polymerase chain reaction,RT-PCR)的SYBR試劑源自TaKaRa公司；miR-210、U6的反轉(zhuǎn)錄和PCR引物由上海生工生物有限公司提供。(3)總RNA提取 按miRcute miRNA提取分離試劑說明書抽提樣品總RNA。(4)總RNA純度和濃度檢測 純度檢測:用RNase-free水將分光光度計調(diào)零,取待測總RNA,測定其A260與A280的OD值。重復(fù)3次,求平均值,取A260/A280=1.8～2.1的樣本用于下一步實驗。濃度測定:操作同上,取三次平均值。加入適量RNase-free水調(diào)整濃度至0.1μg /μL。樣品RNA濃度計算公式為：OD260×40×稀釋倍數(shù)(μg /μL)。(5)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和熒光定量PCR 用AMV逆轉(zhuǎn)錄酶和與其互補(bǔ)的反義引物逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。再取2 μg cDNA加入20 μL Real-time PCR體系，擴(kuò)增條件為：95 ℃預(yù)變性15 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，測定熒光強(qiáng)度，重復(fù)40個循環(huán)；72 ℃延伸7 min。使用U6為實驗內(nèi)參。miR-210 Forward Primer:5’-ACACTCCAGCTGG

GCUGUGCGUGUGACAGC-3’,Reverse Primer:5’-CT

CAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGTC

AGCCGC-3’,U6 Forward Primer:5’-CTCGCTTCGGC

AGCACA-3’,Reverse Primer:5’-AACGCTTCACGAA

TTTGCGT-3’。

1.3 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用2-△△CT法進(jìn)行分析。變化倍數(shù)>2為高表達(dá)，<0.5為低表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 兩組患者的臨床資料比較

符合標(biāo)準(zhǔn)的入組患者共90例，實驗過程中出現(xiàn)排除標(biāo)準(zhǔn)中的疾病，大血管性梗塞患者1例，確診腫瘤患者1例、失去聯(lián)系患者1例，死亡患者1例，共排除4例，最終分析病例為86例。從病例資料入選時的一般特點可見，年齡、腔隙性梗死與癡呆或嚴(yán)重認(rèn)知功能下降有關(guān)，組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05) ，見表1。

表1 兩組患者的基本臨床資料比較

*P<0.05，對照組與實驗組比較。

2.2 miR-210的表達(dá)

對照組、實驗組1年和實驗組2年中miR-210的表達(dá)水平分別為：0.98±0.10、2.44±0.15和2.54±0.09。與對照組相比，實驗組1年和實驗組2年miR-210的表達(dá)顯著升高(P<0.05)，兩組實驗組之間則無明顯差異(P>0.05)。說明有癡呆或嚴(yán)重認(rèn)知功能障礙的老年患者血漿中miRNA-210的表達(dá)水平明顯高于無癡呆或嚴(yán)重認(rèn)知功能障礙的老年患者。見圖1。

3 討論

癡呆現(xiàn)已發(fā)展為老年醫(yī)學(xué)科臨床常見疾病之一，其中血管性癡呆和阿爾茲海默病最為常見，臨床上以記憶力下降，執(zhí)行力、注意力、精神反應(yīng)速度損害為特點，嚴(yán)重影響了患者的生活質(zhì)量[4]，故該疾病的診治是醫(yī)學(xué)領(lǐng)域目前相當(dāng)熱門的話題。

傳統(tǒng)的神經(jīng)病學(xué)認(rèn)為阿爾茲海默病的發(fā)病機(jī)制與血管性癡呆絕對不同，阿爾茲海默病為神經(jīng)變性病，故該病的診斷將血管因素絕對排除在外[5]。但近些年來的研究發(fā)現(xiàn)這兩類癡呆均存在低灌注狀態(tài)，與皮質(zhì)下缺血缺氧息息相關(guān)[6]，其中阿爾茲海默病患者可能是由于血流動力學(xué)的改變，促進(jìn)了神經(jīng)纖維纏結(jié)和老年斑形成。而這兩類癡呆患者均由于腦動脈血流量減少或中斷，導(dǎo)致局部腦組織長期缺血、缺氧，從而引起了相應(yīng)神經(jīng)功能的缺損[7-8]。miR-210就是一種在缺氧狀態(tài)下，由HIF-1α(hypoxia induced factor 1α)誘導(dǎo)產(chǎn)生的miRNA[9]。在缺血的腦皮質(zhì)中miR-210表達(dá)明顯上調(diào)，通過激活Notch1 信號通路，調(diào)節(jié)缺血后的血管再生[10]。由于miR-210在血漿和腦脊液中可以直接檢測到，并且其含量與大腦中miR-210含量成正比，這就方便我們通過監(jiān)測外周血中miR-210的含量間接了解大腦中miR-210的含量[11]。這不同于其他標(biāo)志物，miR-210可以反應(yīng)分子水平的變化，幫助我們研究疾病的機(jī)制[12]。從本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，有癡呆或嚴(yán)重認(rèn)知功能障礙的老年患者血漿中miRNA-210的表達(dá)水平明顯高于無癡呆的老年患者。但隨著腦損傷的進(jìn)一步加重，腦組織在長期的皮質(zhì)下缺血缺氧的過程中產(chǎn)生的miR-210可能達(dá)到相對穩(wěn)態(tài)，所以對于已經(jīng)確診的癡呆患者的miR-210并沒有隨著時間的推移快速增長。在今后的研究中，可以以不同時間節(jié)點和癡呆嚴(yán)重程度對miR-210進(jìn)行監(jiān)測。另由于對照組2年miR-210采集數(shù)量不足，故僅以1年抽取的數(shù)值作為對照，結(jié)合實驗1年和2年miR-210的結(jié)果，我們推測對照組1年與2年miR-210的數(shù)值可能也無明顯差異。該推論可在今后的研究中再行證實。

我國既是人口大國，同時也進(jìn)入了老齡化快速發(fā)展期，我國老年癡呆的患病人數(shù)也將迅速增加，預(yù)計到2040年，我國老年癡呆患者人數(shù)將是所有發(fā)達(dá)國家癡呆患者的總和。對于癡呆的精準(zhǔn)診斷和有效治療的研究就刻不容緩，本研究發(fā)現(xiàn)miRNA-210在癡呆或嚴(yán)重認(rèn)知功能障礙的發(fā)生發(fā)展過程中可能起著重要調(diào)控作用，可進(jìn)一步深入研究其內(nèi)在機(jī)制。

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(學(xué)術(shù)編輯：張小東)

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Effects and mechanism of miRNA-210 in plasma of elderly patients with dementia

HUANG Jing-jing1，YAN Lan-yun2，YU Zhen1，F(xiàn)ENG Mei-jiang1，LU Xiang3

(1.DepartmentofGeriatrics，TheSecondAffiliatedHospitalofNanjingMedicalUniversity,Nanjing210011;2.DepartmentofNeurology，TheFirstAffiliatedHospitalofNanjingMedicalUniversityNanjing210029;3.DepartmentofGeriatrics，SirRunRunHospitalofNanjingMedicalUniversity,Nanjing211166,Jiangsu,China)

Objective：Investigate the expression change of miRNA-210 in the plasma of elderly patients with dementia or severe cognitive impairment,and explore the clinical significance of miRNA-210.Methods：MiRNA-chips were used to detect changes in plasma miRNA-210 levels in elderly patients (with or without dementia or severe cognitive impairment).Results:The expression of miRNA-210 in the plasma of elderly patients with dementia or severe cognitive impairment was significantly higher than that in elderly patients without dementia or severe cognitive impairment.Conclusion:MiRNA-210 may play an important regulatory role in the development of dementia or severe cognitive impairment,and further study its intrinsic mechanism.

Dementia;Severe cognitive impairment;miRNA

10.3969/j.issn.1005-3697.2017.03.010

南京醫(yī)科大學(xué)科技發(fā)展基金重點資助項目(2015NJMUZD036)

2017-04-14

黃菁菁(1983-)，女，博士，主治醫(yī)師，講師。E-mail:jingjinghuang@njmu.edu.cn

魯翔，E-mail:luxiang66@njmu.edu.cn

時間：2017-6-21 18∶09 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/51.1254.R.20170621.1809.020.html

1005-3697(2017)03-0352-03

R749.16

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