血清MK和Th17/調節性T細胞對類風濕關節炎患者病情發生發展的影響

馬信文，董澤民，王勇，李洪

(攀枝花市第二人民醫院骨外科1、檢驗科2，四川攀枝花617065)

血清MK和Th17/調節性T細胞對類風濕關節炎患者病情發生發展的影響

馬信文1，董澤民1，王勇1，李洪2

(攀枝花市第二人民醫院骨外科1、檢驗科2，四川攀枝花617065)

目的觀察Th17/調節性T細胞(Treg)免疫失衡在類風濕關節炎(RA)患者發病時的作用，探討血清中期因子(MK)和Th17/調節性T細胞(Treg)對RA患者病情發生發展的影響。方法選取2013年3月至2016年1月在攀枝花市第二人民醫院接受治療的RA患者58例，根據RA是否處于活動期，將26例DAS28≤3.2者納入非活動組，32例DAS28＞3.2納入活動組，另將30例健康者作為對照組，采用酶聯免疫吸附法對三組受檢者的血清MK、白介素-17(IL-17)、白介素-6(IL-6)、白介素-23(IL-23)水平進行檢測，利用流式細胞術檢測調節性T細胞和外周血Th17細胞的比例變化，并對其比例變化和血清MK、IL-17、IL-6、IL-23的水平進行比較。結果活動組患者的Th17、調節性T細胞比例分別為(1.90±1.00)%、(1.58±1.03)%，非活動組分別為(0.98±0.36)%、(3.92±1.29)%，對照組分別為(0.57±0.21)%、(8.01±1.44)%，活動組血清MK為(342.36±68.39)pg/m L，非活動組為(257.91±56.79)pg/m L，對照組為(200.14±83.42)pg/m L，活動組血清MK及Th17、調節性T細胞比例分別與非活動組比較，差異均具有統計學意義(P＜0.05)，活動組與非活動組的血清MK及Th17、調節性T細胞比例分別與對照組比較，差異均具有統計學意義(P＜0.05)。活動組IL-17、IL-6和IL-23分別為(28.74±4.37)ng/L、(12.84±2.38)ng/L、(74.27±11.74)ng/L，非活動組分別為(19.25±3.27)ng/L、(9.36±2.74)ng/L、(52.29±13.83)ng/L，對照組分別為(6.01±3.28)ng/L、(5.99±2.92)ng/L、(27.37±10.27)ng/L，活動組與非活動組的IL-17、IL-6和IL-23水平分別與對照組比較，差異均具有統計學意義(P＜0.05)。結論RA患者的血清MK上升，且類風濕性關節炎患者Th17/Treg平衡中Th17相對增高，而Treg會相對降低，MK的上升和Th17/Treg平衡失調都促進了RA的發生發展。

中期因子；調節性T細胞；類風濕關節炎

類風濕關節炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種自身免疫性疾病[1]。目前RA的發病機制不明，大多數醫生認為，其原因是感染引起遺傳易感個體的自身免疫反應。傳統觀點認為RA病理生理的改變主要由前炎性CD4+的Thl介導[2]。RA患者Th17細胞相對升高，而調節性T細胞(Treg)則相對下降，Th17/細胞有所偏倚，而導致兩群細胞比例異常的重要因素與白介素-6 (IL-6)、白介素-23(IL-23)和白介素-17(IL-17)等相關細胞因子的異常有關[3-4]。調節性T細胞調節Th17細胞分化的重要機制是RORγt和Foxp3平衡被打破，在一定程度上抑制了Th17細胞的分化。本文將探討血清中期因子(MK)和Th17/調節性T細胞對類風濕關節炎患者病情的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取我院于2013年3月至2016年1月期間治療的RA患者58例，RA患者根據美國風濕學會1987年的RA分類標準及疾病活動度DAS28評分，分為活動組和非活動組，其中DAS28≤3.2為非活動組26例，DAS28＞3.2為活動組32例。排除標準：(1)合并其他免疫系統及風濕性疾病；(2)合并其他慢性疾病；(3)明顯血液學指標異常。另將30例健康者作為對照組。RA患者病程2～13年，活動組患者中男性18例，女性14例，平均年齡(56±13)歲；非活動組患者中男性16例，女性10例，平均年齡(58±11)歲；健康組中男性17例，女性13例，平均年齡(58±15)歲。三組受檢者臨床資料比較差異均無統計學意義(P＞0.05)。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑和儀器KDC-40低速離心機，奧地利產Sunrise TECAN型酶標，杭州四季清公司產胎牛血清。IL-17、IL-16、IL-23、TGF-B ELISA試劑盒均購自美國R&D公司。

1.2.2 檢測方法(1)檢測細胞因子：首先測定三組受檢者血清IL-17、IL-23、IL-6及MK水平，采用酶聯免疫吸附法(ELISA法)，試劑盒購自美國R&D公司，操作按試劑盒提供的說明書進行；(2)Th17的測定：采用流式細胞術進行檢測，用RPM ll640稀釋后，再將25IxL PMA、20斗L Ionomy-cin加入，在37℃條件下進行孵育5 h。設同型對照管和檢測管(f分別為A管、B管)，2.5 txL CD-PerCP和2.5 L CD8-FITC分別加入A管、B管，孵育約15 m in，加入Reagent A，在避光條件下放置約15 min。清洗后，兩只試管都加入100IxLFix&Penn中的溶血液和破膜。在避光條件下放置約15 m in后清洗，清洗后加500 tzL磷酸鹽緩沖液(PBS)重懸。(3)Treg的測定：將50斗L加入10 txL FITC-CD4/ APC-CD25(肝素鈉抗凝全血)溶血洗滌后棄上清，使用1 m L新鮮配置的Fixation/Permmeabilization液混勻，在溫度為4℃條件下進行孵育大約2 h。洗滌后，加入1 IxL正常鼠血清，4℃封閉約15 m in，并將10斗L PE加入，抗人Foxp3mAb于4℃孵育約30 m in，經洗滌后，用500斗L染色緩沖液重懸，上機分析。

1.3 統計學方法應用SPSS19.0統計軟件進行數據分析，計數資料比較采用χ2檢驗，計量資料以均數±標準差()表示，采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，均以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 三組受檢者的Th17和調節性T細胞及MK比較活動組Th17、調節性T細胞及MK分別與非活動組比較差異均具有統計學意義(P＜0.05)，活動組與非活動組的Th17、調節性T細胞及MK分別與對照組比較差異均具有統計學意義(P＜0.05)，見表1。

表1 三組受檢者的Th17和調節性T細胞比例比較(，%)

表1 三組受檢者的Th17和調節性T細胞比例比較(，%)

注：與非活動組比較，aP＜0.05；與對照組比較，bP＜0.05。

例數組別Th17(%)調節性T細胞(%)MK(pg/m L) 32 26 30活動組非活動組對照組F值P值1.90±1.00ab0.98±0.36b0.57±0.21 32.709＜0.05 1.58±1.03ab3.92±1.29b8.01±1.44 80.489＜0.05 342.36±68.39ab257.91±56.79b200.14±83.42 31.698＜0.05

2.2 三組受檢者的I-17、IL-6和IL-23水平比較活動組IL-17、IL-6和IL-23水平分別與非活動組相比較差異均具有統計學意義(P＜0.05)，活動組與非活動組的IL-17、IL-6和IL-23水平分別與對照組比較，差異均具有統計學意義(P＜0.05)，見表2。

表2 三組受檢者的IL-17、IL-6和IL-23水平比較(，ng/L)

表2 三組受檢者的IL-17、IL-6和IL-23水平比較(，ng/L)

注：與非活動組比較，aP＜0.05；與對照組比較，bP＜0.05。

組別IL-23例數IL-17 IL-6活動組非活動組對照組F值P值74.27±11.74ab52.29±13.83b27.37±10.27 60.168＜0.05 32 26 30 28.74±4.37ab19.25±3.27b6.01±3.28 68.321＜0.05 12.84±2.38ab9.36±2.74b5.99±2.92 53.292＜0.05

3 討論

RA是一種慢性自身免疫性疾病，目前其具體的發病機制仍不清楚。近年來，研究發現Thl7是能夠分泌IL-17的Th細胞亞群[1]。細胞可發揮免疫調節作用，并且是淋巴細胞中的重要組分，其維持機體的免疫穩定的作用主要通過抑制自身反應性T細胞的功能實現，以有效避免自身免疫病的發生。MK是一種肝素結合生長/分化因子，在腫瘤發生、發展以及預后過程中具有很重要的影響[5-6]。本文旨在探討血清MK和Th17/調節性T細胞對類風濕關節炎患者病情發生發展的影響。

調控Th17細胞分化的轉錄因子有很多，但最重要的就是RORγτ，這種因子會促進Th17生成[7]；同時，RORγτ一個關鍵的活化信號就是信號傳導與轉錄激活因子，信號傳導與轉錄激活因子會促進RORγτ的分化，也會促進Th17生成，因此我們通常認為信號傳導與轉錄激活因子是Th17的調節因子[8-9]。本研究中，三組受檢者血清MK及Th17和調節性T細胞比例比較結果顯示，活動組血清MK及Th17、調節性T細胞比例分別與非活動組相比較差異具有統計學意義(P＜0.05)，活動組與非活動組的血清MK及Th17、調節性T細胞比例分別與對照組相比差異具有統計學意義(P＜0.05)，這說明Th17/細胞亞群失衡在RA發病中具有很大影響。有研究報道，IL-6和IL-17在嚙齒類動物還是人類均為Thl7細胞生長發育的重要細胞因子[7]，本實驗用ELISA法對RA患者血清中IL-6和IL-17、IL-23濃度進行測定，發現其濃度均明顯高于對照組。

綜上所述，類風濕關節炎患者的血清MK升高，且類風濕性關節炎患者Th17/Treg平衡中Th17相對增高，而Treg會相對降低，MK的升高和Th17/Treg平衡失調可能共同參與并促進了RA的發生發展。

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讀者·作者·編者

標準醫學名詞表(待續)

(本表以全國自然科學名詞審定委員會公布的《醫學名詞》為據)

Effects of serum MK and Th17/regulatory T cells on the development of rheumatoid arthritis.

MA Xin-wen1, DONG Ze-min1,WANG Yong1,LI Hong2.Orthopeadic Surgery1,Clinical Laboratory2,the Second People's Hospital of Panzhihua,Panzhihua 617065,Sichuan,CHINA

Objective To investigate the role of Th17/regulatory T(Treg)cells imbalance in onset patients w ith rheumatoid arthritis(RA),and to explore the effects of serum midkine(MK)and Th17/Treg cells balance on the development of RA.Methods A total of 58 cases of RA patients treated in the Second People's Hospital of Panzhihua between March 2013 to January 2016 were enrolled.According to whether RA was active,patients were divided into inactive group(DAS28≤3.2,26 cases),and active group(DAS28＞3.2,32 cases),and 30 healthy people were selected as controls.Enzyme linked immunosorbent assay(ELISA)was used to detect in three groups the levels of serum MK,interleukin-17(IL-17),IL-6 and IL-23;flow cytometry was used to analyze the proportional change of Th17 cells and Treg cells in peripheral blood.Comparison were explored on the change between the proportion of Th17 cells and Treg cells, serum MK level and values of IL-17,IL-6,IL-23.Results The proportion of Th17 cells and Treg cells in active group were(1.90±1.00)%,(1.58±1.03)%,respectively,which were(0.98±0.36)%,(3.92±1.29)%in inactive group and(0.57± 0.21)%,(8.01±1.44%)%in control group,respectively.The level of serum MK in active group was(342.36±68.39)pg/m L, (257.91±56.79)pg/m L in inactive group and(200.14±83.42)pg/m L in control group.A ll the results(the level of serum MK and the propotion of Th17 and Treg cells)showed statistically significant difference between active group and inactive group(P＜0.05).The levels of IL-17,IL-6 and IL-23 in active group were(28.74±4.37)ng/L,(12.84±2.38)ng/L, (74.27±11.74)ng/L,respectively,(19.25±3.27)ng/L,(9.36±2.74)ng/L,(52.29±13.83)ng/L in inactive group,and(6.01± 3.28)ng/L,(5.99±2.92)ng/L,(27.37±10.27)ng/L in control group,respectively.Statistically differences were showed both in active group and inactive group when compared to the control group(P＜0.05).Conclusion Serum MK level Is significantly elevated in RA patients,who revealed a relatively high frequency of Th17 cells and low number of Treg cells on Th17/Treg balance.An elevated serum MK level and impared Th17/Treg balance both promote the occurrence and development of RA.

M idkine;Regulatory T cells;Rheumatoid arthritis

不宜用厭食藥癮藥原性伊萊亞森卡環伊娃系列胰泌素胰臟移行上皮移植抗原遺傳圖遺傳性出血性毛細管擴張疑病癥異常β脂蛋白血癥異卵雙生抑胃肽易感性癔病隱性眼鏡嬰兒型脊髓性肌萎縮嬰兒型進行性脊髓性肌萎縮癥熒光抗體宜用畏食藥物依賴藥源性RPA卡環汞合金懸突磨除器促胰液素胰腺變移上皮組織相容性抗原連鎖圖奧斯勒-韋伯-朗迪病疑病性神經癥家族性高脂血癥Ⅲ型二卵雙生糖依賴性胰島素釋放肽易患性癔癥接觸鏡韋德尼希-霍夫曼病韋德尼希-霍夫曼綜合征熒光素標記抗體不宜用硬癱幽門口尤爾畸形右胸導管釉髓原發綜合征原核原淋巴細胞圓柱鏡約翰遜矯治器甾類激素在體巴爾體巴氏小體疤痕白蛋白白塞綜合征白色梗死白血球斑釉牙半乳糖神經酰胺脂質貯積癥宜用痙攣性癱瘓幽門羊皮紙樣右心室右淋巴導管[成釉器]星網狀層原發復合征前核淋巴母細胞柱鏡片雙絲弓矯治器類固醇激素體內性染色質X染色質瘢痕清蛋白貝赫切特綜合征貧血性梗死白細胞氟牙癥球形細胞腦白質營養不良

R593.22

A

1003—6350（2017）13—2128—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2017.13.020

2017-01-11)

馬信文。E-mail：403627894@qq.com