OAZ1基因穩定表達SCC15細胞株的構建及其對舌鱗狀細胞癌上皮間質化的影響

王星，姜立，張沄，陳肖燕

(1.西南醫科大學附屬醫院炎癥與變態反應實驗室，四川瀘州646000；2.廣東省人民醫院醫學研究中心，廣東廣州510080)

OAZ1基因穩定表達SCC15細胞株的構建及其對舌鱗狀細胞癌上皮間質化的影響

王星1，姜立2，張沄1，陳肖燕2

(1.西南醫科大學附屬醫院炎癥與變態反應實驗室，四川瀘州646000；2.廣東省人民醫院醫學研究中心，廣東廣州510080)

目的探索鳥氨酸脫羧酶抗酶(OAZ1)對舌鱗癌細胞株SCC15上皮間質化的影響及相關機制。方法構建框移位點突變的OAZ1過表達慢病毒表達載體pLVX-Neo-OAZ1-IRES-ZsGreen，包裝病毒并感染SCC15細胞，采用有限稀釋法挑取熒光強度較高的單克隆細胞株；利用RT-PCR和Western blot檢測OAZ1以及上皮間質化相關基因(E-cadherin、Vimentin、N-cadherin、Zeb1、Snail、Tw ist1、TGF-β1、Smad1)的mRNA水平和蛋白水平。結果成功構建了OAZ1基因穩定表達的SCC15細胞株，且OAZ1的過表達可以抑制Vimentin、N-cadherin、TGF-β1的mRNA和蛋白水平表達；此外，OAZ1可以促進Smad1的蛋白水平降低。結論OAZ1可以抑制舌鱗癌細胞的上皮間質化，其機制可能涉及TGF-β1信號通路和Smad1信號通路的抑制。

鳥氨酸脫羧酶抗酶；舌磷狀細胞癌；慢病毒；上皮間質化

鳥氨酸脫羧酶抗酶(OAZ1)最早發現其可與鳥氨酸脫羧酶(ODC)結合，并靶向使之被26S蛋白酶體降解，從而減少細胞內多胺的水平，影響基因的復制、轉錄以及細胞的增殖[1]。更多研究表明，作為抑癌基因，OAZ1的功能具有多樣性，其不僅可通過誘導CyclinD1、Mps1的非泛素化降解影響細胞增殖以及細胞的遺傳穩定性[2-3]；此外，OAZ1還具有誘導細胞分化與凋亡的作用[4-5]。

舌鱗狀細胞癌(TSCC)是口腔癌中最常見的惡性腫瘤，一般惡性程度高，生長快，浸潤性強，轉移早，預后差，復發率高[6]。近年的統計資料顯示，舌鱗狀細胞癌的發病率呈現明顯上升的趨勢，并且有發病低齡化的傾向[7]。上皮間質化(EMT)是指上皮細胞經轉分化(即由高分化狀態向低分化狀態轉化)變為具有間質細胞表型的生物學現象，其不僅可使腫瘤細胞獲得遷移和侵襲特征，還可使腫瘤細胞獲得干細胞特性[8]。EMT是上皮來源的舌鱗狀細胞癌發生轉移的關鍵啟動步驟，參與舌鱗狀細胞癌侵襲轉移[9]。大量研究表明，高分化舌鱗狀細胞癌的預后較低分化鱗狀細胞癌更好[10]，且在多種舌鱗癌細胞系中，OAZ1的表達水平降低[11]。進一步研究表明，在舌鱗癌細胞中異位表達外源OAZ1可誘導細胞分化[12]。然而，OAZ1是否可以通過誘導舌鱗癌細胞分化抑制EMT尚不明確。本研究應用慢病毒將OAZ1框移位點突變基因導入SCC15細胞，獲得OAZ1基因穩定表達的SCC15細胞株，并進一步探索OAZ1對EMT的影響。

1 材料與方法

1.1 材料DMEM/F12培養基；胎牛血清(Gibco,USA)；Lentivirus質粒系統由深圳百恩微生物公司提供；限制性內切酶Eco RⅠ、XbaⅠ，T4DNA Ligase購自美國NEB公司；OAZ1,Vimentin,N-cadherin抗體購至abcam公司；TGF-β1，Smad1抗體購至Santa Crus公司；G418為Merck公司產品；PrimeScript RT試劑盒、SYBR Premix E×Taq、RNAisoPlus、RNA free dd H2O購自TaKaRa公司。

1.2 方法

1.2.1 慢病毒表達載體的構建本實驗選擇含有OAZ1基因框移位點缺失突變的質粒pET-32a-OAZ1 (前期已經構建完成)作為模板，PCR擴增OAZ1框移位點缺失突變基因(687 bp，205位的T缺失)，并且在片段兩端分別引入Eco RⅠ和XbaⅠ酶切位點。pLVX-Neo-IRES-ZsGreen載體與擴增的缺失突變基因產物經Eco RⅠ和XbaⅠ雙酶切并連接，連接產物pLVX-Neo-OAZ1-IRES-ZsGreen轉化JM 109感受態細胞，擴大培養后抽提質粒，酶切測序鑒定。

1.2.2 慢病毒包裝利用磷酸鈣沉淀法將四質粒系統共轉染293T細胞，24 h后更換新鮮培養基，當細胞熒光強度達最強時，收集含病毒的培養基上清，0.22 μm針頭濾器過濾獲得OAZ1慢病毒，分裝后置于-80℃冰箱保存備用。

1.2.3 細胞培養與穩轉株的篩選SCC15細胞用含10%胎牛血清的DMEM/F12(100 μg/m L鏈霉素、100 IU/m L青霉素)，于37℃、5%CO2培養箱中培養。細胞按1×105/孔接種于六孔板，用OAZ1慢病毒和作為對照的GFP慢病毒感染SCC15細胞，共培養24 h后換液繼續培養。細胞出現綠色熒光后，用G418 (1 000 μg/m L)進行篩選，擴大培養后使用有限稀釋法挑取帶綠色熒光的單克隆細胞。

1.2.4 定量PCR檢測OAZ1、E-cadherin、Vimentin、N-cadherin、Zeb1、Snail、Tw ist1、TGF-β1的mRNA水平按RNAiso Plus試劑盒操作說明提取細胞總RNA。使用PrimeScript RT試劑盒將RNA逆轉錄成cDNA，Real-time RT-PCR體系10 μL，采用兩步法PCR擴增程序：95℃預變性30 s；95℃15 s，58℃45 s，40個PCR循環；55℃～95℃，0.5℃/s變溫速度讀取熔解曲線。引物序列見表1。

基因名稱OAZ1(NM_004152)引物-F -R -F -R -F -R -F -R -F -R -F -R -F -R -F -R -F -R引物序列(5'-3') TCTCCCTCCACTGCTGTAGTAACC GTTGAGAATCCTCGTCTTGTCGTT CTACAATGCCGCCATCGCTTA CACTGATGACTCCTGTGTTCCTGTT TATGAAGGAGGAAATGGCT AGTTTGGAAGAGGCAGAGA GGTAATCCTCCCAAATCAA GGTAATCCTCCCAAATCAA AAGTGGCGGTAGATGGTAA TTGTTGTATGGGTGAAGCA CGAGTGGTTCTTCTGCGCTA CTGCTGGAAGGTAAACTCTGGA GCCGGAGACCTAGATGTCATT CCCACGCCCTGTTTCTTTGA GACAGCAGGGATAACACACT ATGAGAAGCAGGAAAGGC CGCTGAGTACGTCGTGGAGTC GCTGATGATCTTGAGGCTGTTGTC引物長度(bp) 198 E-cadherin(NM_001317184.1)98 Vimentin(NM_003380.3)140 N-cadherin(NM_001308176.1)175 Zeb1(NM_001128128.2)104 Snail(NM_005985.3)157 Tw ist1(NM_000474.3)151 TGF-β1(NM_000660.5)107 GAPDH(NM_002046)172

1.2.5 Western blot使用預冷磷酸鹽緩沖液(PBS)洗細胞三次，加入裂解液(含PMSF)提取的細胞總蛋白。用12%的分離膠進行SDS-PAGE凝膠電泳，電轉至PVDF膜上，5%脫脂奶粉于室溫封閉2 h，一抗4℃孵育過夜。二抗4℃孵育2 h，ECL法顯影，應用FluorChem 8900軟件進行掃描灰度分析。

1.3 統計學方法應用SPSS16.0軟件進行數據分析，計量資料以均數±標準差()表示，多組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 構建慢病毒表達載體pLVX-Neo-OAZ1-IRES -ZsGreen以pET-32a-OAZ1質粒為模板，PCR擴增OAZ1框移位點缺失突變基因(687 bp,205位的T缺失)，并且在片段兩端分別引入Eco RⅠ和XbaⅠ酶切位點，測序鑒定顯示擴增片段準確無誤，205位的T已經缺失。測序結果如圖1。將擴增得到的OAZ1目的片段連接到pLVX-Neo-IRES-ZsGreen慢病毒表達載體中，連接產物pLVX-Neo-OAZ1-IRES-ZsGreen轉化JM 109感受態細胞，擴大培養后抽提質粒，經酶切測序鑒定pLVX-Neo-OAZ1-IRES-ZsGreen重組載體構建成功(圖2)。

圖1 OAZ1突變基因的測序結果

圖2 pLVX-Neo-OAZ1-IRES-ZsGreen雙酶切驗證

2.2 病毒包裝及OAZ1基因穩定表達SCC15細胞株的構建四質粒系統共轉染293T細胞，更換新鮮培養基后24 h熒光強度達到最高(圖3)，故在此時離心收集含病毒的上清液，過濾獲得OAZ1慢病毒。使用獲得的慢病毒感染HEK293細胞，更換新鮮培養基后24 h于熒光顯微鏡下計數熒光細胞數目，生物學滴度測定結果顯示，OAZ1病毒為2×107TU/m L(圖4)。使用OAZ1慢病毒及GFP慢病毒感染SCC15細胞，然而G418篩選后，SCC15/OAZ1細胞株的熒光率未達到75%以上(圖5)。故使用有限稀釋法挑取9株熒光強度較高的單克隆細胞進行培養(圖6A)。Western blot和定量PCR驗證OAZ1的表達情況。結果顯示，相對于對照組SCC15細胞和轉染空載體的SCC15/GFP細胞，實驗組SCC15/OAZ1-1，SCC15/OAZ1-7，SCC15/ OAZ1-8，SCC15/OAZ1-9等4株單克隆細胞中OAZ1的mRNA水平均顯著上調(圖6B)。進一步Western blot結果顯示，SCC15/OAZ1-8細胞中OAZ1蛋白水平上調最為顯著(圖6C)。故選擇SCC15/OAZ1-8細胞用于后續的研究。

圖3 四質粒系統轉染293T細胞包裝病毒(×10)

圖4 倍比稀釋法測定慢病毒滴度(×10)

圖5 OAZ1慢病毒和GFP慢病毒穩定轉染SCC15細胞株(×20)

圖6 OAZ1穩定轉染的單克隆細胞株篩選(×20)

2.3 OAZ1抑制舌鱗癌細胞SCC15的上皮間質化檢測EMT相關基因(E-cadherin、Vimentin、N-cadherin、Zeb1、Snail、Twist1、TGF-β1)的mRNA水平，結果顯示，在SCC15/OAZ1細胞中，Vimentin，N-cadherin和TGF-β1的mRNA水平顯著降低，而E-cadherin、Zeb1、Snail、Twist1的mRNA水平沒有明顯變化(圖7A)。Western blot結果顯示，OAZ1的過表達可抑制Vimentin、N-cadherin和TGF-β1的蛋白水平(圖7B)，表明OAZ1可以抑制舌鱗癌細胞SCC15的上皮間質化，其機制可能涉及TGF-β1的轉錄抑制。進一步研究結果顯示，相對于對照組SCC15細胞和轉染空載體的SCC15/GFP細胞，實驗組SCC15/OAZ1中Smad1的蛋白水平顯著降低，然而其mRNA水平沒有明顯變化(圖7A，B)。提示，OAZ1可能通過促進Smad1的降解抑制SCC15細胞的上皮間質化。

圖7 OAZ1抑制舌鱗癌細胞SCC15的上皮間質化

3 討論

OAZ1在細胞增殖分化以及凋亡中起重要調控作用，其因在多胺代謝中的重要調控地位以及誘導部分細胞內重要大分子的非泛素依賴降解作用而備受關注[5,13]?，F已證實OAZ1作為一個抑癌基因具有抗腫瘤特性[14]。研究顯示，在舌鱗癌癌細胞中，OAZ1可以誘導細胞向終末分化，且抑制細胞的增殖[12]。然而，OAZ1是否參與調控舌鱗癌細胞上皮間質化過程尚不明確，故對其進行深入研究，將有助于OAZ1在舌鱗狀細胞癌治療中的研究應用。

為了研究OAZ1對舌鱗癌細胞上皮間質化的影響，本研究利用攜帶OAZ1框移位點缺失突變的慢病毒構建OAZ1穩定表達的舌鱗癌細胞株SCC15/OAZ1。然而經G418篩選后，SCC15/OAZ1細胞株的熒光率未達到75%以上。為了進一步提高陽性細胞的百分率，我們通過有限稀釋法挑取帶綠色熒光的單克隆細胞進行培養。經定量PCR和Western blot檢測發現，SCC15/OAZ1-8細胞中OAZ1的mRNA水平和蛋白水平均顯著高于對照組，表明我們已經成功構建OAZ1穩定表達細胞株。

上皮間質化在舌鱗癌轉移中發揮關鍵作用。E-cadherin是鈣粘蛋白超家族成員，可介導細胞間連接，其作為上皮標志物在鱗狀細胞癌中表達水平顯著下調[15]。然而，定量結果顯示在SCC15/OAZ1細胞中E-cadherin的mRNA表達水平沒有顯著變化。研究表明，在上皮間質化過程中，間質細胞標志物Vimentin、N-cadherin以及EMT相關的轉錄因子Zeb1、Snail和Tw ist1的表達水平上調[16-17]。我們的研究結果顯示，在SCC15/OAZ1細胞中間質細胞標志物Vimentin、N-cadherin的mRNA水平顯著降低，然而EMT相關的轉錄因子Zeb1、Snail和Tw ist1的mRNA水平沒有明顯變化。進一步的實驗表明，在SCC15/OAZ1細胞中Vimentin、N-cadherin蛋白水平顯著降低。這些結果表明，在舌鱗癌細胞中OAZ1的過表達可以抑制上皮間質化，然而其機制可能并不涉及調控Zeb1、Snail和Tw ist1等轉錄因子的表達。

TGF-β1信號通路在促進腫瘤細胞上皮間質化中扮演重要作用，TGF-β1可以通過激活Smad2/3信號通路促進上皮間質化[18]。故我們檢測了OAZ1對TGF-β1的影響，結果顯示，OAZ1可以抑制TGF-β1的mRNA水平以及蛋白水平。此外，有研究顯示，BMPs/Smad1信號通路的激活同樣可以促進上皮間質化[19-23]。而OAZ1可與Smad1以及HsN3形成Smad1-HsN3-OAZ1三元復合物，并且介導Smad1的非泛素依賴性降解[24-25]。故我們檢測了Smad1的蛋白水平，結果顯示OAZ1可以促進Smad1的降解。因此推測，OAZ1可能通過抑制TGF-β1信號通路和Smad1信號通路抑制舌鱗癌細胞的上皮間質化。然而OAZ1抑制舌鱗癌細胞上皮間質化的確切分子機制還需進一步研究。

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Establishment of SCC15 cell line stably expressing human OAZ1 gene and its influence on the epithelialmesenchymal transition of tongue squamous cell carcinoma.

WANG Xing1,JIANG Li2,ZHANG Yun1,CHEN Xiao-yan2.1.Laboratory of Inflammation and Allergy,the Affiliated Hospital of Southwest Medical University,Luzhou 646000,Sichuan,CHINA;2.Medical Research Center,Guangdong General Hospital,Guangzhou 510080,Guangdong, CHINA

Objective To investigate the role of OAZ1 in epithelial mesenchymal transition(EMT)in tongue squamous cell carcinoma cell lines SCC15 and explore its related mechanism.Methods The lentivirus vector pLVX-Neo-OAZ1-IRES-ZsGreen in which the target gene OAZ1 was modified at the frameshift site was constructed, packaged lentivirus and infected SCC15 cells,and the monoclonal cell lines w ith high fluorescence intensity were obtained by lim ited diluted method.Real-time PCR and Western blot was used to detect the expression of OAZ1 and the genes(E-cadherin,Vimentin,N-cadherin,Zeb1,Snail,Tw ist1,TGF-β1,Smad1)related w ith EMT.Results The SCC15 cell line w ith stable expression of OAZ1 gene was successfully constructed.The overexpression of OAZ1 inhibited the protein level and mRNA level of the Vimentin,N-cadherin,TGF-β1.Furthermore,the OAZ1 would promote the degradation of Smad1.Conclusion OAZ1 can inhibit the EMT of tongue squamous cell carcinoma cell lines through the possible mechanism related w ith the inhibition of TGF-β1and Smad1 pathway.

Ornithine decarboxylase antizyme 1(OAZ1);Tongue squamous cell carcinoma(TSCC);Lentivirus;Epithelial mesenchymal transition(EMT)

R739.86

A

1003—6350（2017）13—2065—07

10.3969/j.issn.1003-6350.2017.13.001

2017-04-14)

國家自然科學基金(編號：30901757)

姜立。E-mail：lijiang3434@yeah.net