不同寄主來源的葡萄霜霉病菌的孢子囊大小和致病力分化的測定

劉志君，莫光珍，張書溢，易圖永,3,4

（1湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，長沙410128；2湖南省靖州縣農(nóng)業(yè)局，湖南靖州418400；3植物疾病控制與利用湖南省高校重點(diǎn)實驗室，長沙410128；4植物病蟲害生物學(xué)與防控湖南省重點(diǎn)實驗室，長沙410128）

不同寄主來源的葡萄霜霉病菌的孢子囊大小和致病力分化的測定

劉志君1，莫光珍2，張書溢2，易圖永1,3,4

（1湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，長沙410128；2湖南省靖州縣農(nóng)業(yè)局，湖南靖州418400；3植物疾病控制與利用湖南省高校重點(diǎn)實驗室，長沙410128；4植物病蟲害生物學(xué)與防控湖南省重點(diǎn)實驗室，長沙410128）

為了減少葡萄霜霉病在經(jīng)濟(jì)上造成的損失，采集湖南、福建、江西三省的不同地區(qū)、不同葡萄品種的19份葡萄霜霉病菌，檢測了它們的孢子囊大小和在‘戶太八號’、‘夏黑’、‘醉金香’、‘紫秋葡萄’、‘維多利亞’5個不同葡萄品種的致病力差異。通過保濕培養(yǎng)病原菌，再接至健康葉片上，根據(jù)孢子萌發(fā)法測長度和葉盤法測其致病力。結(jié)果表明，采自不同葡萄品種的霜霉病菌孢子囊大小存在一定的差異，來源于‘刺葡萄’的病原菌孢子囊明顯大于來源于‘巨峰’、‘紅地球’上的霜霉病菌孢子囊；來源于江西的菌株致病性普遍較強(qiáng)，而來源于湖南的菌株致病性普遍較弱。歐美雜交種葡萄，如‘戶太8號’、‘夏黑’、‘醉金香’，其病情指數(shù)相對較低；歐亞雜交種和東亞種葡萄，如‘維多利亞’，‘紫秋葡萄’，其病情指數(shù)相對偏高。上述結(jié)果表明，采集自不同寄主的葡萄霜霉病菌的致病力和孢子囊大小均存在一定程度的分化。

葡萄霜霉病菌；分化；致病力；病情指數(shù)；孢子囊大小

0 引言

葡萄霜霉病(Grape downy mildew)是葡萄生產(chǎn)中的主要病害[1-3]，由葡萄霜霉病菌(Plasmopara viticola)引起的，可造成大面積減產(chǎn)，進(jìn)而造成巨大經(jīng)濟(jì)損失，是制約葡萄產(chǎn)業(yè)發(fā)展的一大瓶頸。葡萄霜霉病菌(Plasmopara viticola)是一種古老的世界性病害，在雨熱同季地區(qū)發(fā)生尤其嚴(yán)重，是葡萄穩(wěn)產(chǎn)、高產(chǎn)的主要限制因素之一[4]。葡萄霜霉病屬多循環(huán)氣傳病害，一旦環(huán)境條件適宜，易于迅速發(fā)生和流行，極具毀滅性[5-6]。同時，葡萄霜霉病潛育期短、再侵染頻繁、病菌繁殖率高的特點(diǎn)[7]，葡萄霜霉病害在我國各地的葡萄產(chǎn)區(qū)普遍發(fā)生，該病原菌致病力分化明顯。目前，國外方面，有研究表明來自各地的葡萄霜霉病菌呈現(xiàn)出鮮明的寄主專化性。在孢子囊形態(tài)方面，不同來源的霜霉病菌差異明顯[8]。國內(nèi)，目前對葡萄霜霉病的研究大致是對發(fā)病情況、田間消長規(guī)律、防治藥劑篩選以及抗性鑒定的研究，在致病力方面，劉旭等[9]和黃曉慶等[10]研究了新疆、重慶、河北、陜西、遼寧地區(qū)來源不同的葡萄霜霉病病株的致病力和孢子囊形態(tài)。為了研究湖南、江西、福建3個省份葡萄霜霉病菌致病性的分化情況，本研究針對不同地區(qū)葡萄霜霉病菌，研究其在致病力上的分化，采集湖南、江西、福建3個省份19株典型葡萄霜霉病菌開始致病性研究，統(tǒng)計19株菌株的致病性數(shù)據(jù)，在病害的綜合防治方面，提供了重要的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌株 分別采自湖南、福建、江西省地的‘巨峰’、‘紅寶石’、‘紅瑞寶’、‘金手指’、‘刺葡萄’、‘紅地球’6個品種，詳細(xì)信息見表1。

表1 菌株收集信息詳情

1.1.2 接種材料 在一周無施藥的情況下，從湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)耘園葡萄種植基地采集‘戶太八號’、‘夏黑’、‘醉金香’、‘刺葡萄’和‘維多利亞’葡萄葉片。再用直徑10 mm的打孔器取分別在其5個不同品種的葉片上取下20個葉盤進(jìn)行實驗[11]。

1.2 試驗方法

1.2.1 病原菌的采集與培養(yǎng) 把釆回的新鮮葡萄霜霉病感病葉片進(jìn)行蒸餾水洗滌[12]，置于墊有濕濾紙的托盤中進(jìn)行時長24 h的保濕培養(yǎng)，待新生孢子囊長出后馬上將其刮下，再用無菌水配制成孢子囊懸浮液，同時統(tǒng)計其濃度，1.6×105個/mL為宜。在配成的孢子囊懸浮液后，于室溫下培養(yǎng)1～2 h，再取一滴孢子囊懸浮液置于顯微鏡下觀察，當(dāng)有游動孢子出現(xiàn)時，則可以進(jìn)行接種|13]。

1.2.2 不同來源寄主葡萄霜霉病菌孢子囊大小的測量從收集的病樣上挑取少許孢子囊，配制成孢子囊懸浮液，做成玻片放于10×40倍顯微鏡下統(tǒng)計其數(shù)據(jù)，再任意每個樣品里挑50個孢子囊記錄其長寬數(shù)據(jù)，最后對其統(tǒng)計其方差。1.2.3致病力測定 在托盤中放置1張裁剪好并且使用蒸餾水將濾紙沾濕，用橫五豎四排列方式將同一品種的20個葉盤排列在一個角落。將20 μL孢子囊懸浮液先滴在前3列的15個葉盤上，然后再用20 μL蒸餾水滴在最后1列的5個葉盤作為對照。用保鮮膜封住托盤進(jìn)行保濕，置于溫度為22℃，相對濕度95%的人工氣候箱中培養(yǎng)中，再進(jìn)行12 h光照[14]。通常在接菌后3～4天，白色菌絲會出現(xiàn)在葉片上，5～10天后，侵染達(dá)到頂峰。此時記錄其發(fā)病情況，根據(jù)葡萄霜霉病在離體接種上的分級標(biāo)準(zhǔn)（表2）和葡萄霜霉病在抗感級上的級別分化標(biāo)準(zhǔn)（表3）計算出病情指數(shù)，反復(fù)3次，再取其平均值[15]。

表2 葡萄霜霉病在離體接種上的分級標(biāo)準(zhǔn)

表3 葡萄霜霉病在抗感級上的級別分化

以被接種葉盤的病情指數(shù)作為抗性分級的指標(biāo)和鑒定效果分析。病情指數(shù)的計算見公式(1)。

2 結(jié)果與分析

2.1 致病力測定結(jié)果

從長沙市長沙縣、福州永泰、贛州興國、懷化靖州、懷化麻陽、懷化中方、懷化芷江、衡陽衡山、衡陽市衡陽縣、南昌新建、萍鄉(xiāng)蘆溪、邵陽洞口、新余分宜、宜春萬載、永州新田、漳州長泰17個地方收集得到的19株葡萄霜霉病菌，通過致病力試驗顯示，19株樣品都能感染5個葡萄品種的發(fā)病。介于葡萄品種在抗病性上的高低和葡萄霜霉病菌在上致病力的分化，其發(fā)病程度上有所差異。在發(fā)病癥狀方面，初期時，葉盤發(fā)病有半透明的不規(guī)則淺褐色油績狀斑點(diǎn)長出，病情加重后，逐漸融合成黃褐色不定形的大病斑[16-18]，最后在病斑部位出現(xiàn)白色霜狀霉層[19]（圖1）。

在‘戶太八號’葡萄上，宜春布塘的菌株的致病性最強(qiáng)，長沙市長沙縣2015年的樣品致病性最弱；在‘夏黑無核’葡萄上，宜春萬載的菌株具有最強(qiáng)的致病性，湖南省衡陽衡山的菌株致病性最弱；在‘醉金香’葡萄上，萍鄉(xiāng)蘆溪的菌株具有最強(qiáng)的致病性，永州新田的菌株致病性最弱；在‘維多利亞’葡萄上，萍鄉(xiāng)蘆溪的菌株具有最強(qiáng)的致病性，邵陽洞口的菌株致病性最弱；在‘紫秋葡萄’上，南昌新建的病株引起發(fā)病能力最高，衡陽衡山的樣品引起發(fā)病能力最低。

從整體上看來（表4），來自萍鄉(xiāng)蘆溪的菌株致病性最強(qiáng)，源于衡陽衡山的菌株致病性最弱。綜合所有數(shù)據(jù)，從江西省采集的樣品致病性普遍較強(qiáng)，而從湖南省采集的樣品致病性普遍較弱。

2.2 不同地理位置采集霜霉病株在孢子囊大小的測量

測量不同地區(qū)病株的孢子囊大小，結(jié)果（表5）顯示，不同地區(qū)病株的孢子囊大小具有明顯差異(F=43.34，P＜0.05)。所有樣品中，孢子囊最長可達(dá)到35.26μm，最短是 11.42 μm。孢子囊最寬可達(dá)到 25.37 μm，最窄是8.03 μm。

圖1 葡萄葉盤發(fā)病圖

表4 不同地理位置采集的葡萄類別的樣品在致病力上的測定

為了更加透徹孢子囊大小的改變規(guī)則，把之前病株按類別進(jìn)行不同排比，觀察其群體內(nèi)及群體間孢子囊大小。不同地區(qū)來源的霜霉病菌類別間的孢子囊長度(F=52.38，P＜0.05)和寬度(F=68.12，P＜0.05)都存在顯著差異（圖2）。結(jié)果顯示，來源于‘刺葡萄’菌株的孢子囊在長寬上明顯大于其余品種。來自于‘紅地球’、‘巨峰’、‘紅寶石’的菌株在孢子囊在長寬數(shù)據(jù)方面上無明顯差別；而收集自同一類別無論是同一地理位置采集還是不一樣的地理位置采集的葡萄樣品在孢子囊大小方面都有明顯差別（圖3），因而得出病原菌的孢子囊大小和對應(yīng)收集的地理位置目前無顯著相關(guān)的結(jié)論。然而非同一類別的霜霉病菌在孢子囊大小上的確有特定程度的分化。

續(xù)表4

表5 不同地區(qū)葡萄霜霉病菌的孢子囊大小

圖2 非同一類別來源的葡萄霜霉病群體孢子囊大小

圖3 相同寄主來源的葡萄霜霉病群體在孢子囊大小上的比較

3 討論

孢子囊萌發(fā)方面，前有研究報道，霜霉病游動孢子會向氣孔游動形成休止孢，長出芽管從氣孔侵入。經(jīng)摸索后發(fā)現(xiàn)高濃度在發(fā)病上能產(chǎn)生更好效果，最終決定用1.6×105/mL來作為病菌處理的濃度，這也與Polesani等[20]、Díez-navajas等[21]、Liu等[22]在研究中所使用的孢子囊量相近，可以實現(xiàn)較好的發(fā)病效果。

相比于之前劉旭等[9]和李榮[12]的研究，研究創(chuàng)新點(diǎn)在于2015年和2016年的同一時間在長沙縣和懷化中方處地點(diǎn)進(jìn)行采樣。相對以往地點(diǎn)采集，本研究的反復(fù)步驟更加具有意義。

由于致病力測量試驗還不具有一套成規(guī)及成熟的寄主，所以在不同的試驗中采用的致病力測量的寄主也許有一定的差異。因為隸屬于活體營養(yǎng)專性寄生菌，葡萄霜霉病菌在活菌的保留和擴(kuò)繁操作上，具有些許困難。所以對于不同寄主的病原菌的收集十分受限。這在特定程度上不利于本試驗對其發(fā)病能力的更深入統(tǒng)計和證明。建議以后采集更多省份的病株，以及每年同一時間在同一地點(diǎn)重復(fù)采集樣品進(jìn)行比較，這樣數(shù)據(jù)能更據(jù)說服力。

為了更加接近田間反應(yīng)以及節(jié)約成本，本試驗采取葉盤法對霜霉病菌的發(fā)病能力實行檢測，數(shù)據(jù)表示不同病株對相同處理葉片的發(fā)病表現(xiàn)不同，而且來自非同一類別的病菌群體之間的發(fā)病能力差別明顯。根據(jù)研究結(jié)果可以看出，在19個葡萄霜霉病菌株中具有顯著的致病性分化現(xiàn)象，在5個不同葡萄品種上都能表現(xiàn)出不同程度的致病性并且菌株發(fā)病能力的強(qiáng)弱和葡萄品種有特定程度的聯(lián)系。在5個供試葡萄品種中，‘戶太八號’、‘夏黑無核’、‘醉金香’隸屬對葡萄霜霉病抗病性較高的歐美雜交種葡萄，因此其病情指數(shù)相對較低；而‘維多利亞’和‘紫秋葡萄’分別隸屬感病的歐亞雜交種和東亞種葡萄，故其病情指數(shù)相對偏高。

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致謝：感謝易圖永老師對本試驗的指導(dǎo)和對該文章的修改，感謝實驗室的馬琳和譚玉嫻給予的多方面的幫助和支持。

Sporangia Size of Plasmopara viticola from Different Hosts and Determination of Pathogenicity Differentiation

Liu Zhijun1,Mo Guangzhen2,Zhang Shuyi2,Yi Tuyong1,3,4
(1Institute of Plant Protection,Hunan Agricultural University,Changsha 410128,Hunan,China;2Jingzhou County Agricultural Bureau of Hunan Province,Jingzhou 418400,Hunan,China;3Hunan Provincial Key Laboratory of Plant Disease Control and Use,Changsha 410128,Hunan,China;4Plant Diseases and Insect Pests in Hunan Province Key Laboratory of Biological Prevention and Control,Changsha 410128,Hunan,China)

The aim is to reduce the economic loss of Plasmopara viticola.19 accessions of Plasmopara viticola from different grapes were collected from different areas in Hunan,Fujian and Jiangxi.The sporangia size was determined,and the differences of pathogenicity in‘Hutai No.8’,‘Summer Black’,‘Zuijinxiang’,‘Ziqiu Grape’and‘Victoria’were detected.The pathogenic bacteria were cultivated by moisture culture,and then were inoculated to the healthy leaves.The length was detected by sporangium germination method and the pathogenicity was determined by leaf-disc method.The results showed that the size of downy mildew bacterium sporangium from different grape varieties was different.The pathogenic bacteria sporangium from‘Spine grape’was obviously greater than that of‘Kyoho Grape’and‘Red Earth’.The bacterial strain fromJiangxi had generally stronger pathogenicity,but the bacterial strain from Hunan had generally weaker pathogenicity.European-American cross species grape,such as‘Hutai No.8’,‘Summer Black’and‘Zuijinxiang’had relatively low pathogenicity.European-Asian cross species and East Asian species,such as‘Victoria’and‘Ziqiu Grape’had relative high pathogenicity.The above result indicates that there is a certain differentiation in the pathogenicity and sporangium size of downy mildew collected from different hosts.

Plasmopara viticola;Differentiation;Pathogenicity;Disease Index;Sporangia Size

S436.631.1

A論文編號：cjas16110025

農(nóng)業(yè)部公益行業(yè)計劃“果樹霜霉病綜合防控技術(shù)研究與示范”(201203035)。

劉志君，男，1992年出生，湖南衡陽人，在讀碩士，研究方向：植物病理學(xué)。通信地址：410128湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，E-mail：349323806@qq.com。

易圖永，男，1971年出生，湖南懷化人，教授，研究方向：植物病理學(xué)。通信地址：410128湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，Tel：0731-84617025，E-mail：yituyong@hotmail.com。

2016-11-17，

2016-12-28。