復方君子湯誘導白血病K562細胞凋亡的機制研究

陳毅寧　梁春靈　廖斌　皇甫真萍　齊彥　陳佳薇

摘要：目的本研究探討復方君子湯（FFJZ）對抑制白血病K562細胞生長增殖和誘導凋亡的作用機制。方法 用不同濃度復方君子湯作用于K562細胞，應用MTF法觀察復方君子湯對K562細胞生長增殖的影響，AnnexinV/PT染色和流式細胞儀（FCM）檢測細胞凋亡，Western blot檢測Caspase-8蛋白及Fas蛋白的表達。結果在一定濃度的復方君子湯作用后的K562細胞的增殖被抑制，隨著濃度的增加及使用時間的延長，K562細胞的增殖抑制率及凋亡比例明顯增加；同時，Caspase-8蛋白及FaS蛋白的表達明顯上升。結論一定濃度的復方君子湯可抑制K562細胞增殖并誘導其凋亡，其機制可能與上調Caspase-8蛋白及Fas蛋白的表達有關。

關鍵詞：復方君子湯；白血病；K562細胞；細胞凋亡；機制

中圖分類號：R289.5 文獻標志碼：A 文章編號：1007-2349（2017）03-0018-04

白血病是一種常見的惡性血液系統腫瘤，嚴重危害人類生命健康，細胞分化與凋亡受阻是白血病發病的重要機制之一，因此探索誘導白血病細胞凋亡的新藥是目前研究白血病治療的熱點之一。中醫認為白血病的發病是由于機體正氣虧虛，邪毒傷髓，毒瘀互結，繼而發病，治療上當遵循益氣養陰、扶正祛邪與活血化瘀三法并用之原則，復方君子湯是福建中醫藥大學附屬人民醫院經過臨床實踐總結而成，在急性白血病的臨床治療中取得良好療效。為進一步研究復方君子湯抗白血病的生物學作用，筆者觀察了復方君子湯對人白血病細胞K562生長的影響，并對其相關作用機制進行了探討。現將結果報道如下。

1材料和方法

1.1主要試劑 復方君子湯（黨參20 g，黃芪20 g，茯苓15 g，白術15 g，川芎10 g，浙貝母10 g，補骨脂10 g，甘草6 g等）由福建中醫藥大學附屬人民醫院中藥制劑室提供。四甲基偶氮唑藍（mehyl-thazol-tetrazolinum，MTF）購自Serva公司；胎牛血清（bovine scrtlln albumin，BSA）購自杭州四季青生物公司；臺盼藍購自Chroma公司；改良型PRMI-1640培養基為海克隆生物化學制品公司產品；二甲亞砜（Dimethyl sulfoxide，DMSO）購自北京化工廠；AnnexinV/PI細胞凋亡檢測試劑盒購自北京寶賽生物技術有限公司。

1.2細胞來源 人紅白血病細胞株K562由河南省腫瘤醫院中心實驗室提供。

1.3主要儀器 倒置相差顯微鏡（IX71型）為日本OLYMPUS公司產品；水套式c02培養箱（CJ-1100型）為長沙長棉應用技術研究所產品；立式滅菌器（LMQ·C型）為山東新華醫療器械公司生產；電熱恒溫鼓風干燥箱（DHG-9143BS-Ⅲ型）為上海新苗醫療器械公司產品；酶標儀（Model680型）為BIORAD公司生產；凈化工作臺（SW-CJ-1F型）為蘇凈集團公司產品；流式細胞儀（Coulter EPICS型）為Beckman Coulter公司產品；高速低溫離心機（Allegra TMX一12R型）為Beckman公司產品。

1.4細胞培養 K562細胞使用含10%小牛血清、鏈霉素及青霉素各100U/ml的nyQ改良型PRMI-1640培養液培養，置于濃度為5%，溫度為37℃、濕度為100%的C02培養箱中培養，每2-3天換液1次，選取對數生長期細胞進行實驗。

1.5MTF法測定細胞增殖抑制率 選取對數生長期K562細胞按2.0×10⁵/ml密度分別接種于96孔培養板，隨機分為五組，分別為：①空白對照組；②As：03組：加入AS₂O₃（終濃度為3×10^-6mol/L）；③復方君子湯組：加復方君子湯（終濃度分別為2.0、6.0、10.0mg/mL），每組設8個平行復孔，置于CO₂培養箱中共同培養，分別于24 h，48 h.72 h取各組培養板，每孔加入20μlMTF（5.0，.g/mE），繼續培養4 h，離心后棄上清液，加入100ulDMSO，搖勻并震蕩10min，在酶標儀上讀取450 nm處測吸光值。計算K562細胞增殖抑制率（%）=[1-（實驗組平均吸光度/細胞對照組平均吸光度）]×100%。

1.6AnnexinV/PI雙染色法和流式細胞儀（FCM）檢測細胞凋亡 分別收集各組培養24 h，48 h，72 h后的細胞，并將其濃度調整為5.0×10⁵/mL。將細胞重懸浮于100μL結合緩沖液（10mmol/L HEPES，pH 7.4，140 nunol/L NaOH，2.5 mmnol/LCaCl₂）。加入10 uL AnnexinV和5 uL PI，輕輕混勻，4℃避光反應30分鐘。再加入100μl結合緩沖液，在1小時內上機檢測熒光強度，重復3次。

1.7Westem blot檢測Caspase-8蛋白及Fas蛋白的表達 收集經10.0mg/L的復方君子湯處理后的K562細胞2.0×10⁵/ml，經離心、PBS緩沖液洗滌，同時設立不加藥物的空白對照組，用1 xNuPAGE LDS細胞裂解液（含50mmol/L二硫蘇糖醇，DTF）裂解細胞后，采用考馬斯亮藍法（Coomassie Assay）測定總細胞提取液中的蛋白濃度。取30μg經SDS-PAGE電泳分離，然后轉移至醋酸纖維素膜上，5%無脂牛奶封閉2h，加一抗在4℃過夜孵育，TBS緩沖液洗滌3次，二抗室溫孵育2h，化學發光法檢測蛋白表達。

1.8統計學方法 采用SPSS19.0統計軟件。計量資料以（x±s）表示，兩組均數之間比較采用t檢驗；組間比較采用單因素方差分析；計數資料采用卡方檢驗。

2結果

2.1MTF法測定不同濃度組的細胞增殖抑制率 2.0、6.0、10.0 mg/ml的復方君子湯分別作用于K562細胞24 h、48 h、72h后的細胞生長抑制率（表1，圖1）。檢測結果顯示，2.0 mg/ml的復方君子湯組與空白對照組無顯著差別（P>0.05），其余各濃度組K562細胞的抑制率與藥物濃度及使用時間呈正相關（r=0.699），各濃度組與空白對照組相比有顯著差異（P<0.01）。

2.2AnnexinV/PI檢測不同濃度組的細胞凋亡率 隨作用濃度的增加凋亡率也逐漸增高，2.0 mg/L的復方君子湯對K562細胞的誘導凋亡作用不明顯，與空白對照組比較無統計學差異（P>0.05），而6.0mg/L的復方君子湯使K562細胞早期凋亡比例明顯增高，與空白對照組比較有統計學差異（P<0.01），而濃度達到10.0 mg/L時，細胞晚期凋亡比例明顯增多，與空白對照組比較有統計學差異（P<0.01）（表2）。

2.3Western blot檢測Caspase-8蛋白及Fas蛋白的表達

Western blot分析結果表明，6.0mg/L及10.0mg/L的復方君子湯作用72h后Caspase-8蛋白及Fas蛋白表達水平明顯升高，和空白對照組比較差異有統計學意義（P<0.01），見表3。

3討論

復方君子湯是本科在臨床實踐中不斷摸索總結而成的經驗方，在臨床運用中取得良好療效。我科前期實驗研究表明復方君子湯對惡性腫瘤化療有明顯增效減毒作用，能明顯逆轉白血病細胞株K562/VCR耐藥性，提高耐藥細胞對阿霉素的敏感性。本研究通過對復方君子湯對白血病細胞K562誘導凋亡的機制研究，以探討復方君子湯誘導白血病細胞凋亡的作用特點，并進一步探討死亡受體信號通路在復方君子湯誘發腫瘤細胞凋亡中的作用，更深入的了解復方君子湯抑制腫瘤的機理，從而為復方君子湯的臨床應用提供更多的實驗和理論依據。本實驗研究結果表明，低劑量的復方君子湯（2.0mg/L）對K562的凋亡基本不起作用，而隨著濃度的升高，6.0mg/L及10.0mg/L的復方君子湯對K562細胞的抑制率及凋亡比例與空白對照組比較均有統計學差異（P<0.01），且與藥物濃度及使用時間呈正相關，其中6.0mg/L的復方君子湯組中I（562細胞早期凋亡比例明顯增高，而10.0mg/L的復方君子湯組中則以晚期凋亡為主。白血病K562細胞經一定濃度的復方君子湯作用后caspase-8及Fas蛋白表達水平明顯升高，與空白對照組比較有明顯統計學差異（P<0.01），說明復方君子湯可能是通過上調Fas蛋白及caspase-8蛋白的表達進而誘導K562細胞的凋亡。

隨著分子生物學的突飛猛進，在中醫藥理論指導下，從中醫藥寶藏中挖掘分子靶向白血病治療藥物具有廣闊的前景。近幾年來中藥有效成分誘導白血病細胞凋亡分子機制的研究取得重大突破，特別是靶向凋亡通路相關蛋白或酶的表達或功能調控的研究成為其中的熱點。如青蒿琥酯可誘導K562細胞凋亡，且具有時間一效應關系，同時上調K562細胞Fas蛋白的表達，下調FasL的表達，Fas/FasL表達的改變可能是青蒿琥酯誘導K562細胞凋亡的機制之一。葛根總黃酮提取物及葛根素、大豆苷元單體均能誘導HL-60細胞凋亡，且可能是Fas死亡受體和/或線粒體途徑所介導。姜黃素可誘導髓系白血病細胞凋亡，引起Fas水平增高，同時Caspase-8和Caspase-9都顯著增高，故推斷其可能通過死亡受體途徑和線粒體途徑來誘導細胞凋亡。這些報道表明Fas/FasL通路的激活可能是不同抗腫瘤中藥活性成分誘導凋亡的共同分子途徑。Fas的凋亡信號主要是通過與其胞漿區相關的死亡結構域蛋白FADD介導的，當Fas與FasL結合后，活化細胞死亡蛋白酶caspase-8，使其活化成具有酶活性的蛋白酶，隨之活化連鎖鏈，導致細胞凋亡。本實驗表明復方君子湯對白血病K562細胞有明顯的抑制生長增殖及誘導凋亡的作用，且與上調Fas蛋白及easpase-8蛋白表達有關，因此，我們推測復方君子湯對白血病K562細胞的凋亡機制可能與Fas-FADD-caspase-8軸有著密切關系，但仍需進一步實驗研究探索。

綜上，通過初步研究證實了一定濃度的復方君子湯在體外可抑制白血病K562細胞增殖并誘導其凋亡，其可能與上調Caspase-8蛋白及Fas蛋白的表達有密切的關系。但復方君子湯誘導K562細胞凋亡的分子機制可能非常復雜，值得進一步深入研究。

（收稿日期：2016-11-28）