都勻白及的組織培養與植株再生研究

胡單晶+聶蓮+楊紅艷

摘 要：近年來由于都勻本地野生白及被大量采挖，數量越來越少。因此，建立白及人工繁殖的方法，通過組織培養建立白及植株再生體系，實現都勻本地中藥產業現代化大量種苗的需求。本次實驗通過植物組織培養技術，對白及進行培養獲得再生苗，然后進行增殖培養，在不同的培養基上人工快速繁殖，以尋找都勻白及無性快繁體系的培養條件。結果表明：最佳叢芽增殖培養基為：1/2MS+6-BA 3ml/L+KT 1ml/L+2，4-D 1ml/L；最佳叢芽的生根培養基為：1/2MS+6-BA 2ml/L+KT 1.5ml/L+ NAA 1ml/L。

關鍵詞：白及；中藥材；組織培養；無性快繁；都勻

白及（Bletilla striata Rchb.f.）屬蘭科（Orchidaceae）白及屬（Bletilla Rchb.f.）多年生草本植物。花的顏色主要有紫色、白色、黃色、紅色和藍色等，形奇特，可作盆景觀賞[1]。白及別名白及、干根、連及草[2]。藥用部分在中藥里又稱良姜、紫蘭。李時珍在《本草綱目》中解釋其名為：其根白色，連及而生，故曰白及。白及一般生長在灌木叢下、草坡或路旁濕潤處。主要分布于云南、陜西、四川、湖北、甘肅等省份，全國各地有少量栽培[3]。扁球形的假鱗莖，表面有環形紋帶，富有粘性。白及常以其塊莖根入藥，具有補肺，收斂止血，消腫生肌等功效[4-5]。近年來，隨著對白及的研究開發利用的不斷深入，白及不僅具有廣泛的藥用價值和園林價值外，也廣泛用于生產日用百貨，例如化妝品、高級陶瓷制造、紡織、橡膠等都需要白及的參與[6]。因為白及的利用價值，市場對白及的需求量也漸漸增大，野生資源急劇減少[7]。白及種子十分微小，在自然條件下繁殖效率低，成本高。所以采用組織培養繁殖十分有必要[8-10]。

白及的常規組織培養繁殖多為利用無菌播種，然后直接長大成苗的技術路線。從優良單株為起點，保證基因一致性。通過此方法可實現全年均衡生產，更靈活地滿足市場需求，縮短生產周期，降低成本，從而加快推進白及中藥產業現代化進程[11]。

本實驗采用植物組織培養技術，對分布于貴州省都勻市地區的野生白及進行培養，建立無性快繁體系，為產業化生產大量種苗奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

白及（Bletilla striata Rchb.f.）于2015年9月采自都勻市綠茵湖社區高坡，憑證標本存黔南民族師范學院植物標本館。

1.2 方法

1.2.1消毒滅菌

假鱗莖先用75%酒精浸泡5-10s，立即用無菌水沖洗10次左右。后用0.1% HgCl2消毒5 min，立刻用無菌水漂洗3-8次，將消毒好的外殖體接種在已滅菌好的培養基上，移到培養室進行培養。

1.2.2培養基與培養條件

苗培養基：以MS培養基或1/2MS培養基為基本培養基，添加相關激素：6-芐氨基嘌呤（6BA）、激動素（KT）、2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）、萘乙酸（NAA）。應用正交表L16（4）4設計不同因素水平配比的培養基配方；pH值5.8-6.4為宜。

在超凈臺工作臺中將進行滅菌處理好的白及外植體接入相應的培養基中，置于溫度（20±3）℃，光照強度1500lx，光照時間為10h/d的條件下進行培養。

1.2.3誘導和繼代培養

將滅菌處理好的外殖體接種到設計好的培養基上，每7 d觀察1次，并做好相關各項記錄。

1.2.4白及的生根培養

將培養后的叢生芽分成單株，接種在生根培養基上，每7 d觀察1次，并作相應記錄。

2 結果與分析

本次實驗通過正交設計，可得16個處理梯度。每個梯度做1L的培養基，平均分裝在35個培養瓶中，每個培養瓶接種10個叢芽數，1周后觀察并統計結果。

2.1 叢芽的增殖培養

由于此次實驗是在利用都勻白及的種子培養后的種苗為基礎進行增殖和生根培養，所以利用正交設計后，進行個梯度的培養，在實驗過程中，各個梯度都有增殖芽發生，但是統計下來，1/2MS+6-BA3ml/L+KT1ml/L+2，4-D1ml/L培養基培養出來的增殖芽數最多，而且芽長勢優良，粗壯茂盛，葉嫩綠發亮。其余的培養基的苗多少出現不同程度的問題。因此決定采用1/2MS+6-BA3ml/L+KT1ml/L+2，4-D1ml/L為增殖培養基進行后續的增殖培養，并且得到了大量的優質組培苗。

2.2 叢芽的生根培養

在正交設計實驗過程中，同時也得到了苗的生根培養基。在本次試驗過程中，由于出現了有苗在5d后長根的現象，而且有根長勢正常，粗壯，長，不定根多的情況，因此在芽的生根培養時，直接采用這里面生根最多最好的培養基進行生根培養，即1/2MS+6-BA2ml/L+KT1.5ml/L+NAA1ml/L。

3 討論

都勻白及在自然狀態中繁殖，或者在人們原生態的傳統種植方法下，白及的繁衍增殖幾率比較低，原本市場對白及的需求量就較大，于是會出現白及市場供不應求的情況。本實驗采用白及無性快繁的方式，縮短都勻白及的繁殖周期，在一定程度上滿足市場需求。在借鑒前人對白及快繁的研究成果時，發現前輩們都會在培養過程中除了加入相關的植物激素外，還在不同程度上加入香蕉泥、椰子汁和土豆泥等輔助成分。然而在本次試驗中，僅僅只是在基本培養基中加入一定量的相關激素，同樣可得到顯著的效果。這樣操作簡便，既節省精力又節約資本的方法，可在今后對都勻白及的工業化生產中大力推廣。

在植物組織培養與快速繁殖過程中，植物激素能在很大程度上影響著植物體細胞胚狀體的發生與發育。在培養過程中，一定量的植物激素是增殖分化、生根的必要條件，通常使用6-BA、KT、2，4-D以及NAA等較為常規的植物激素。6-BA和2，4-D利于愈傷組織分化成不定芽，且很快又分化為叢生芽。本次實驗過程中，當6-BA與2，4-D的濃度比為3：1時，可以快速得到大量的叢生芽。于是在后面的繼代增殖培養過程中，可加入適當的6-BA和2，4-D，以便提高增殖系數，增加叢生芽的數量及產率。解決白及種苗快速繁殖過程中增殖緩慢，導致種苗培養周期長等關鍵性問題，加大了推進都勻本地白及組培種苗產業現代化的進程。

另外，在本次實驗過程中，還發現了在6-BA與NAA組合的培養基培養過程中，NAA濃度高的芽長得最粗壯。同時在這過程中，當沒有2，4-D時，6-BA與NAA比列為2：1時，苗生根情況良好。

盡管前人對白及的組培快繁研究取得了不小的成績，在白及人工快繁方面奠定了一定的基礎，但是都勻本地白及的工業化生產任然受到限制。于是，本次實驗利用白及種子通過植物組織培養技術，培養獲得的再生苗為外植體。在前人研究的基礎上，通過正交實驗設計方法，對再生苗進行增殖培養，誘導再生苗增殖分化產生大量叢生芽。同時，對叢生芽進行生根培養，使其形成完整植株。通過植物組織培養建立都勻白及植株再生快速繁殖體系，白及種苗增殖系數高，解決了都勻本地白及種苗來源問題。可在原有投資基礎上降低成本，大大的縮短了白及的培養周期。逐步實現都勻白及工業化生產，期望滿足市場對白及的大量需求。

參考文獻

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