商陸皂苷甲對IL-1β誘導的腎小球系膜細胞ERK1/2-AP-1通路活化的影響

湯杰印，董 楊，張祥貴，肖 寒，張 薇，徐麗君

(遵義醫學院第五附屬(珠海)醫院腎內科，廣東珠海 519100)

論著·基礎研究

商陸皂苷甲對IL-1β誘導的腎小球系膜細胞ERK1/2-AP-1通路活化的影響

湯杰印，董 楊，張祥貴△，肖 寒，張 薇，徐麗君

(遵義醫學院第五附屬(珠海)醫院腎內科，廣東珠海 519100)

目的 觀察商陸皂苷甲(EsA)含藥血清對大鼠腎小球系膜細胞(rGMC)增殖及其對IL-1β誘導rGMC的ERK1/2-AP-1通路活化的影響。方法 用不同劑量EsA(5、10、20、40 mg/kg)將SD大鼠灌胃后獲取含藥血清，并設對照組(0.5%羧甲基纖維素鈉灌胃)；用上述各組濃度的EsA含藥血清處理rGMC，并設對照組血清組。四甲基偶氮唑藍(MTT)法檢測各組EsA含藥血清對rGMC增殖的影響；將rGMC分為空白對照組、IL-1β單獨作用組、IL-1β+EsA雙重作用組、IL-1β+U016雙重作用組、IL-1β+U0126+EsA共同作用組，同步化后培養48 h，Western Blot法檢測p-ERK1/2、AP-1的表達并成像分析。結果 EsA(5～10 mg/kg)含藥血清抑制了細胞增殖(P<0.05或P<0.01)；IL-1β組促進了rGMC的p-ERK1/2、AP-1表達(P<0.05)，IL-1β+EsA組、IL-1β+U0126組，IL-1β+U0126+EsA組作用rGMC后，其p-ERK1/2、AP-1表達均降低(P<0.05)。結論 EsA含藥血清(5～10 mg/kg)顯著抑制了rGMC的増殖；EsA通過下調p-ERK1/2、AP-1表達，抑制了IL-1β誘導的rGMC增殖，EsA作用于ERK1/2-AP-1通路是其抑制rGMC增殖的機制之一。

商陸皂苷甲；細胞增殖；系膜細胞；AP-1；ERK1/2

腎小球系膜細胞的過度增生是導致慢性腎臟病不斷進展的重要原因，在系膜細胞增生的過程中常伴有細胞外基質在系膜區的沉積，從而引起腎小球濾過率的持續性降低，大量的腎小球硬化導致腎功能不全，最終進展到腎病終末期。因此，推斷如果能夠抑制或阻斷系膜細胞的增殖過程則系膜細胞增生性腎小球腎炎的病理生理過程將能夠得到逆轉，慢性腎衰竭也將能夠在很大程度上得以避免。大量研究結果表明，絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路的激活在引起系膜細胞增殖過程中起到關鍵的作用，而細胞外信號調節激酶(ERK1/2)通路的激活則是MAPK通路啟動、發揮作用的核心環節[1]，在ERK1/2通路中激活蛋白-1 (AP-1)的作用尤為突出，可以推斷抑制ERK1/2-AP-1通路的激活將能夠為防治以系膜細胞增生為發病核心的腎臟疾病提供新的臨床途徑。商陸皂苷甲(EsA)是中藥商陸的單體形式，大量的臨床研究證實其在免疫調節、抗炎、促進細胞凋亡及抑制細胞增殖的多種病理生理調節過程中起著積極作用[2-4]，尤其是對于自身免疫性腎炎動物模型的臨床實驗性治療效果令人滿意[5]。本課題組前期大量的動物模型臨床試驗研究結果已尋找到EsA顯著改善小鼠狼瘡性腎炎模型機體炎癥，蛋白尿及腎功能癥狀隨之緩解的臨床證據，且發現此過程中小鼠疾病模型血清中TNF-a，IL-6的含量顯著下降[6]；在腎臟組織內Bcl-2和PCNA的表達顯著受阻，而Fas、FasL及Caspase-3基因被充分激活，促使腎小球內有核細胞及系膜區面積的減低，充分延緩、逆轉了腎組織的增殖過程，腎臟病理損傷狀況得以逆轉[7-9]；EsA非含藥血清將能夠使P27基因活化水平顯著提高，從而使CDK2基因表達受阻，抑制了大鼠腎小球系膜細胞(rGMC)細胞分裂周期的進程，抑制rGMC的增殖[10-11]。如今，鮮有EsA對GMC增殖的抑制過程經ERK-AP-1信號通路而發揮作用的相關文獻報道。本研究觀察了EsA含藥血清對rGMC增殖及其對IL-1β誘導rGMC的p-ERK1/2、AP-1表達的影響，進一步探討、闡明EsA治療系膜細胞增殖性腎小球疾病的潛在關鍵分子作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料 清潔級實驗用SD雄性大鼠[美國Jackson實驗室提供，動物許可證：SCXK(京)2012-001]；rGMC株(HBZY-1)由CCTCC提供。IL-1β(peprotechlot)，生產批號：100991E0713；EsA(上海源葉公司)，生產批號：KM0521CA14；優級胎牛血清(FBS)、DMEM培養液(美國Thermo公司)，二甲基亞砜(DMSO)、四甲基偶氮唑藍(MTT)(Aladdin)，0.25%胰酶溶液(含酚紅、EDTA)(碧云天生物技術研究所)，U0126(Sigma公司)，羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)(天津大茂化學試劑廠)，RIPA裂解液(碧云天生物技術研究所)，HRP標記山羊抗兔(武漢博士德)，AP-1兔抗鼠IgG抗體(武漢谷歌生物科技)，p-ERK1/2兔抗鼠IgG抗體(北京博奧森)，蛋白Marker(凱基生物)。

1.2 方法和分組

1.2.1 EsA混懸液制備 用電子天平精確量取EsA和2 mL 0.5%CMC-Na溶液充分混勻，即得到實驗用EsA混懸液。

1.2.2 EsA含藥血清制備 將體質量為(248±22)g的20只清潔級健康8周齡實驗用SD雄性大鼠，使用隨機序列發生器分配到對照組(0.5%CMC-Na灌胃)，5 mg/kg EsA血清組，10 mg/kg EsA血清組，20 mg/kg EsA血清組，40 mg/kg EsA血清組。專室分籠裸鼠飼料飼養，隨意飲食，每組4只。適應性喂養2 d后進行胃內藥物灌注，大鼠在進行灌藥前需禁食8 h，自由飲水。根據SD大鼠體質量，將給藥組分別按總劑量5、10、20、40 mg/kg連續3 d進行EsA混懸液胃內灌注，每日進行2次，掌握每次EsA混懸液的胃內灌注量為總量1/6；對照組中使用與實驗組相同劑量的0.5% CMC-Na以便獲得無藥血清。最后一次胃內灌注藥物結束之后1 h內，無菌操作臺中采用經腹主動脈直視下取血，獲得全血后使之常溫下靜置充分凝固，分離血清，所得同組血清可混合，然后經過滅活、過濾除菌之后分裝冷藏備用。

1.2.3 rGMC培養 原代rGMC細胞株，在倒置顯微鏡下呈梭形，平鋪于培養瓶底部，相互不重疊，培養基澄清、透亮，無黑點、細胞碎片等雜質可供用于后續試驗。將其置于恒溫、恒濕度培養箱中培養，定時去除觀察，待rGMC鋪滿培養瓶底部面積的80%～90%時，棄去上清液，并使用2 mL磷酸鹽緩沖液(PBS)將細胞清洗兩遍，充分棄去PBS液后，加入500 μL胰酶溶液輕輕晃動培養瓶，使細胞與胰酶充分接觸，將之放入培養箱中3 min進行消化，取出培養瓶，倒置顯微鏡下觀察可見rGMC細胞變圓形，部分從底部脫落，加入含10%胎牛血清(FBS)的DMEM培養基終止消化，使用移液器輕輕反復吹打，即制備得到單細胞懸液。使用移液器將細胞懸液轉移到離心管中，800 r/min充分離心5 min，棄上清液，再次添加3 mL含10%FBS的DMEM培養液反復吹打，充分混勻。取3個25 mm2培養瓶，每瓶加入含10%FBS的DMEM培養液4 mL，使用移液器向每個培養瓶中各加入上述細胞懸液1 mL，輕輕晃動培養瓶使之充分混勻，然后將培養瓶置于37 ℃，5%CO2恒溫、恒濕培養箱內繼續培養，定期觀察細胞生長狀況，每48 h需進行換液，連續培養72 h可再次進行細胞傳代。待傳代至6～9代rGMC時，細胞生長狀態良好，分裂周期最為穩定，可用于實驗研究。

1.2.4 細胞實驗分組 研究EsA含藥血清對rGMC增殖的影響時，按照血清中EsA的含藥濃度分成：對照組、5 mg/kg EsA血清組、10 mg/kg EsA血清組、20 mg/kg EsA血清組和40 mg/kg EsA血清組；在研究EsA含藥血清對p-ERK1/2、AP-1表達的影響過程中分成空白對照組、IL-1β單獨作用組、IL-1β+EsA雙重作用組、IL-1β+U016雙重作用組，IL-1β+ESA+U016共同作用組。

1.2.5 MTT法檢測EsA對rGMC增殖影響 將傳代至6～9代處于對數生長時期的rGMC接種到96孔板上，先使用無血清培養基在恒溫、恒濕培養箱中孵育24 h使rGMC生長期同步化在G0期。空白對照組使用0.5% CMC-Na進行灌胃處理的大鼠體內獲取的血清，上述實驗過程中的各個實驗組分別待培養至24、48、72 h時，進行換液，并向每個孔中添加20 μL的0.5% MTT后將96孔板放回培養箱繼續培養4 h，培養完成后棄上清液，在每個細胞培養孔內添加DMSO 150 μL，將培養板置于水平震蕩儀上，室溫下，振蕩10 min，使結晶顆粒完全溶解。將細胞培養板置于酶聯免疫檢測儀中，設定490 nm波長，對各細胞培養孔處的吸光光度值(OD值)進行檢測(重復4次)。

1.2.6 蛋白質印跡法(Western Blot)檢測p-ERK1/2表達 細胞傳代、換液、分組和藥物添加處理同前所述。將各實驗組處理完畢，繼續培養48 h(生長至約每組1×106個細胞)，提取各組細胞內部總蛋白，BCA法對每個實驗組中提取的蛋白質濃度進行檢測，提取完畢將蛋白樣品置于-20 ℃冰箱備用。使用時每組蛋白樣品20 μg同5×SDS凝膠加樣緩沖液充分混勻，置于100 ℃水浴箱中充分變性5 min。使用微量加樣器上樣，保證每個電泳孔中添加蛋白樣品等量，使用10%聚丙烯酰胺凝膠進行電泳(其中樣品通過濃縮膠時設定45 V，時間為 40 min；樣品通過分離膠時設定120 V，時間為 90 min)，轉膜過程中電流為350 mA，時間1 h，將樣品充分轉至PVDF膜。轉膜完成，取出PVDF膜，使用含5%脫脂牛奶的封閉液進行封閉1 h；p-ERK1/2 IgG 抗體同封閉液按照1∶2 000的比例進行稀釋，GAPD h 兔抗鼠IgG 抗體使用封閉液按照1∶1 000的比例進行稀釋，將PCDF膜分切完畢，同所對應的1抗封在封閉袋中，置于4 ℃水平恒溫震蕩儀中50 r/min孵育過夜；第2日，取出PVDF膜做好標記，使用TBST進行洗膜，洗膜結束，將PVDF膜與羊抗兔IgG- hRP 抗體(同封閉液按照1∶3 000進行稀釋)共同封在封閉袋中，室溫下，水平震蕩儀上50 r/min，繼續孵育1 h。二抗孵育結束，使用TBST洗膜3遍，取出PVDF膜置于保鮮膜上，正確放置富士感光膠片，將之共同移入夾中，壓片2 min，顯影3 min，定影10 min。所獲取的曝光圖像條帶使用ImageJ 圖像軟件進行灰度分析。GAPDH作為內參條帶，目的條帶與內參條帶灰度值的比值作為各組蛋白質的相對含量數值(上述過程重復3次)。

1.2.7 Western Blot檢測AP-1表達 Western Blot實驗方法同1.2.6所述，AP-1 IgG 一抗同封閉液按照1∶2 000進行稀釋。二抗、圖像采集、處理及統計學分析等過程同1.2.6。

2 結 果

2.1 rGMC形態學觀察 使用倒置光學顯微鏡觀察傳代24 h后的rGMC，可見其平鋪、舒展于細胞培養板或培養瓶的底部，長梭狀、不規則形，相互不重疊，卵圓形的細胞核居于包體中央，胞體周圍有大量樹枝狀突起，培養基澄清。隨著時間推移，細胞數目逐漸增多，細胞間隙縮小，連續培養2～3 d后可鋪滿瓶底。見圖1。

2.2 EsA含藥血清對rGMC增殖的影響 同對照組相比，可觀察到5 mg/kg EsA血清組、10 mg/kg EsA血清組在24、48、72 h時rGMC的增殖受到顯著抑制(P<0.05)。尤其是10 mg/kg EsA血清作用組在48 h時rGMC增殖的抑制作用更為顯著(P<0.01)，并且觀察到細胞培養基澄清，單個細胞的生長狀態良好，故后續試驗可選用10 mg/kg EsA血清組，實驗研究觀察點選擇為48 h。見表1。

圖1 正常培養的腎小球系膜細胞形態(×200)

組別nOD(24h)OD(48h)OD(72h)對照組50．648±0．0480．788±0．0371．245±0．0435mg/kgEsA血清組50．533±0．035a0．709±0．036a1．165±0．021a10mg/kgEsA血清組50．514±0．052a0．655±0．053b1．150±0．018b20mg/kgEsA血清組50．662±0．0720．850±0．0291．299±0．07540mg/kgEsA血清組50．726±0．1260．856±0．0791．303±0．065

a：P<0.05，b：P<0.01，與對照組比較。

2.3 EsA含藥血清對p-ERK1/2蛋白的表達的影響 同空白對照組(0.85±0.10)相比，IL-1β單獨作用組的中p-ERK1/2表達量(1.06±0.04)最高(P<0.05)，其余各觀察組與IL-1β組相比，IL-1β+EsA雙重作用組(0.90±0.02)、IL-1β+U0126雙重作用組(0.90±0.05)、IL-1β+U0126+EsA共同作用組(0.87±0.06)中p-ERK1/2表達顯著降低(P<0.05)。

2.4 EsA含藥血清對AP-1蛋白的表達 IL-1β單獨作用組中AP-1的表達量(1.38±0.02)最高，同空白對照組(0.49±0.02)相比差異有統計學意義(P<0.05)，IL-1β+EsA雙重作用組(0.48±0.02)、IL-1β+U0126雙重作用組(0.82±0.02)、IL-1β+U0126+EsA共同作用組(0.47±0.03)與IL-1β單獨作用組相比，表達量顯著降低(P<0.05)。

3 討 論

EsA是源自一種名為商陸的植物根部提純所得的三萜類皂苷化合物，長期以來多向基礎醫學和臨床醫學相關研究充分證實了該種藥物在抗炎方面所具備的獨特效應。二十一世紀開始我國中醫藥事業的發展受到國家高度重視，大量中藥臨床研究發現許多的中藥對于慢性腎臟疾病有良好治療效果，并能夠逆轉慢性腎臟疾病的病理生理過程。其中，對于EsA的研究過程中其高效的抗慢性腎臟疾病作用的效果令人驚喜，然而其具體的作用機制尚不明確，需要進行進一步的研究。

血清藥理學研究原理即通過向實驗動物胃內灌注待研究藥物的方法，使藥物在動物體內維持一定濃度后，通過收集動物血液進而分離出含有研究藥物的血清，將所得到的血清作用于模擬機體內環境下體外培養的靶細胞，觀察靶細胞在藥物作用下的生長、增值及凋亡等狀態，經過分析得出結論，研究過程科學、嚴謹，實驗過程接近體內環境，結果可信度高[12]。國內學者關曉多等[13]利用LC-IT-MS/MS法對按15 mg/kg EsA進行胃內灌注的大鼠所提取的血清進行分析未檢測出任何內源性干擾物質存在，說明了EsA經胃灌注采集到的動物血清有效成分確定性。本次研究發現：按照5～10 mg/kg EsA進行胃內灌注所得血清作用rGMC在24～72 h后細胞的增殖受到顯著抑制(P<0.05或P<0.01)。另外，本課題研究組之前研究結果已經證實EsA非含藥血清作用于體外培養的rGMC，同樣可顯著抑制其增殖[3]，而且大鼠在經過EsA灌胃之后其血清中商陸EsA藥效穩定[13]，因此可以推斷EsA在體內達到一定濃度之后將對rGMC的增殖起到直接的抑制作用。

IL-1β被大量的研究證實在人體中作為一種關鍵的炎性因子存在，它能夠引起靶細胞分泌大量炎性介質，對自身和周圍細胞的功能進行調節，許多學者提出IL-1β在刺激GMC增殖、引起細胞外基質的分泌等一系列病理生理發生、發展的過程中扮演著重要角色。分子生物學研究證實了IL-1β生物作用的發揮經過MAPK通路及核轉錄因子-ΚB信號通路起作用[14]。而ERK作為MAPK家族中功能最為廣泛的成員，由ERKl、ERK2兩個高度同源的亞類組成，ERK1/2基因指導了此兩個相對分子質量分別為44×103、42×103的蛋白質的具體編碼[15]。ERKl/2主要定位于細胞漿，一定病理作用因素下將轉移到細胞核內，從而引起其作用的下游基因的激活，發揮其調控細胞生長、增殖等過程的生物學效應[16]。U0126作為ERK1/2信號通路中特異性最高的ATP非競爭性ERK抑制劑，能夠即時有效地阻斷ERK信號通路的表達。研究發現，在Ang-Ⅱ誘導的GMC增殖過程中，p-ERK1/2表達上調；Ang-(1-7)抑制GMC增殖，p-ERK1/2入核過程中斷，使促細胞增殖因子的表達量降低，GMC增殖過程得到阻斷或逆轉[17]。AP-1也是一種可指導細胞增殖的轉錄調節蛋白，在外界相關因子作用下引起一些細胞核內增殖相關信號通路的激活。AP-1屬于MAPKs的亞型-ERK1/2、JUK、P38的共同作用底物之一。ERK1/2可使AP-1的C-Jun的絲氨酸Ser73位點磷酸化，因此AP-1為ERK1/2通路中重要的重要轉錄因子之一。已知MCP-1、IL-1β、FN、LN等基因啟動子中均存在與AP-1接合的作用元件(TRE元件)，在細胞增生、分化、凋亡及EMC(FN、LN、ColⅣ等)積聚中發揮重要作用。研究證實，LPS、IL-1β、ET-1和AngⅡ等均可活化GMC中的AP-1，而下調AP-1活性可抑制GMC增殖[18-19]。因此AP-1的活化參與調控了IL-1β等誘導的GMC的增殖及EMC積聚。本研究中P-ERK、AP-1檢測結果顯示：IL-1β作用下rGMC內p-ERK1/2、AP-1基因表達均顯著提高，使ERK1/2-AP-1通路活化，引發了細胞的增殖。EsA、U0126及EsA聯合U016作用下，檢測結果顯示rGMC內p-ERK1/2、AP-1蛋白水平降低，提示其基因表達受阻，然而此三者間p-ERK1/2蛋白表達差異并不顯著，分析原因可能與培養的GMC增殖的速度、檢測指標的時間點及藥物的時效、藥物間空間構象作用效應減弱等因素有關，同時從蛋白質水平提示了U0126沒有促進EsA阻斷ERK通路的作用。針對AP-1表達，IL-1β+U0126組明顯高于IL-1β+EsA組及IL-1β+U0126+EsA組，可能為U0126特異性抑制了ERK1/2通路，下調了AP-1表達，而EsA除阻斷ERK1/2通路外，尚可能阻斷了其他AP-1的上游通路，致AP-1進一步減少，具體機制有待進一步研究。

本次研究充分證實了GMC可能為EsA在腎組織中直接作用的靶細胞，EsA用藥后將有效抑制ERK1/2-AP-1通路，抑制p-ERK1/2、AP-1的表達，從而抑制了系膜細胞的增殖過程，進而慢性腎臟疾病的病理生理過程也將得到有效逆轉。

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Influence of esculentoside A on activation of ERK1/2-AP-1 pathway of glomerular mesangial cell induced by IL-1β*

TangJieyin,DongYang,ZhangXianggui△,XiaoHan,ZhangWei,XuLijun

(DepartmentofNephrology,FifthAffiliatedHospital(Zhuhai)ofZunyiMedicalCollege,Zhuhai,Guangdong519100,China)

Objective To observe the influence of serum containing esculentoside A(EsA) on the proliferation of glomerular mesangial cell (GMC) and the activation of ERK1/2-AP-1 pathway of glomerular mesangial cell induced by IL-1β.Methods SD rats were gavaged by different doses of EsA(5,10,20,40 mg/kg) for getting medicated sera.The control group was set (gavage by 0.5sodium carboxymethylcellulose);the EsA medicated serum was used to treat rGMC.The control serum group was set.The influence of EsA medicated serum in each group on rGMC proliferation was detected by MTT;the rGMC was divided into the blank control group,IL-1β single action group,IL-1β+EsA double action group,IL-1β+U016 double action group and IL-1β+U0126+EsA combined action group,which were synchronized and then cultured for 48 h.Western blot was used to detect the expression of p-ERK1/2 and AP-1 an the imaging analysis was performed.Results The EsA medicated serum(5-10 mg/kg gavage) inhibited the cellular proliferation(P<0.05 orP<0.01);the IL-1β group promoted the expression of p-ERK1/2 and AP-1 in rGMC(P<0.05),after acting on rGMC in the IL-1β+EsA double action group,IL-1β+U0126 double action group and IL-1β+U0126+EsA combined action group,the expression of p-ERK1/2 and AP-1 was decreased(P<0.05).Conclusion Serum containing EsA (5～10 mg/kg gavage) significantly inhibits the rGMC proliferation;EsA inhibits IL-1β induced rGMC proliferation,its action pathway on ERK1/2-AP-1 is one of mechanisms for inhibiting rGMC proliferation.

Esculentoside A;cell proliferation;glomerular mesangial cell;AP-1;ERK1/2

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.16.007

廣東省珠海市醫學科研課題(2014067)。 作者簡介：湯杰印(1975-)，碩士，副主任醫師，主要從事慢性腎臟病臨床及基礎研究。△

，E-mil:zxg5220@163.com。

R285

A

1671-8348(2017)16-2183-04

2017-01-08

2017-03-12)