楸樹雄性不育花芽轉錄組測序及分析*

毛偉兵 陳發(fā)菊 王長蘭 梁宏偉

(三峽大學生物技術研究中心 宜昌 443002)

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楸樹雄性不育花芽轉錄組測序及分析*

毛偉兵 陳發(fā)菊 王長蘭 梁宏偉

(三峽大學生物技術研究中心 宜昌 443002)

【目的】 以自然突變的楸樹雄性不育花芽為研究材料，分析與楸樹雄性不育相關基因的表達模式，從基因的表達水平上揭示楸樹雄性不育的分子機制，為楸樹及木本植物的雄性不育研究提供有價值的參考。【方法】 采用高通量測序技術對自然狀態(tài)下楸樹的雄性不育的花芽以及可育的花芽進行轉錄組測序，通過生物信息學對可育花芽與不育花芽的轉錄本進行比較分析，預測和篩選出與楸樹雄性不育有關的基因。【結果】 轉錄組測序共產生27.18 Gb數據，組裝并去冗余后得到86 076個Unigene，然后將Unigene比對到7大功能數據庫(NR, NT, GO, COG, KEGG, Swissprot，Interpro)進行功能注釋，最終被7大數據庫中任意一個數據庫注釋上的Unigene總數為64 600(75.05%)。將試驗組(雄性不育花芽, SL)與對照組(可育花芽, FL)所測得的Unigene進行表達量的分析后，篩選出表達量有差異且可信度高的差異表達基因。在噪音分布中(差異表達倍數在2以上，可信度在0.8以上)共篩選出試驗組中有6 915個基因上調表達，3 504個基因下調表達。在泊松分布中(差異表達倍數在2以上，錯誤發(fā)生率在0.001以下)，SL-1 vs FL-1、SL-2 vs FL-2、SL-3 vs FL-3三個生物學重復中得出差異上調表達基因分別有13 979，13 513，13 055個，差異下調表達基因分別有12 170，13 807，10 411個。差異基因的GO功能分析表明，在生物過程中顯著性富集的條目集群頻率較高的是生殖過程、生殖發(fā)育過程、生殖系統(tǒng)發(fā)育、生殖結構發(fā)育，在分子功能中只有生長素流出跨膜轉運蛋白活性顯著性富集。差異基因KEGG通路分析中，差異基因映射到127個不同的生物途徑，顯著富集代謝通路中差異基因的生物途徑主要為： 代謝途徑、次生代謝產物的生物合成、剪接體、RNA轉運以及甘油磷脂及淀粉和蔗糖的代謝。在用差異基因與同源基因比對分析中，共比對出246個同源性高的Unigene，其COG功能分類多聚集在RNA加工和修飾，細胞周期控制、細胞分裂、染色體分區(qū)，轉錄等，同時將這些同源性高的差異表達基因映射到了丙酮酸代謝、植物激素信號轉導途徑中。【結論】 楸樹雄性不育的形成與生殖發(fā)育的多個過程、丙酮酸代謝途徑、生長素流出跨膜轉運蛋白活性以及油菜素內酯介導的信號轉導通路密切相關。根據分析的結果和已經完成的相關細胞學觀察，推測楸樹雄性不育的形成可能是楸樹體內丙酮酸代謝過程異常，抑制油菜素內酯的合成，使絨氈層發(fā)育異常并進一步影響到小孢子減數分裂，最終導致不育花粉的形成。

楸樹； 雄性不育； 轉錄組測序； 差異表達基因

楸樹(Catalpabungei)是紫葳科(Bignoniaceae)梓屬(Catalpa)落葉喬木，是我國所特有的珍貴優(yōu)質用材樹種和觀賞樹種，素有“木王”之稱。其樹干通直，花形若鐘，花朵盛開時極其優(yōu)美，自古人們就把楸樹作為觀賞樹種廣泛栽培(王新建等， 2004)。自然條件下，楸樹個體存在雄性不育的現象，小孢子在四分體時期由于絨氈層結構和功能異常而不能正常發(fā)育，造成花藥敗育而不能形成正常的花粉(張博等， 2015)。楸樹通常采用嫁接和扦插等方式進行無性繁殖，長期的無性繁殖導致品種、類型和無性系單一化，且由于其自花不孕，常常使得楸樹只開花不結實，加之對其過度的開發(fā)利用，造成楸樹的資源缺乏。

近年來，轉錄組測序技術迅速發(fā)展，已被廣泛應用到了SSR標記規(guī)模化開發(fā)(文亞峰等， 2015； 張振等， 2015)、代謝途徑的分析(陳昊等， 2015； 馬婧等， 2016)、基因挖掘等方面，同時也在植物雄性不育研究上應用并取得進展。根據已報道的雄性不育轉錄組數據分析表明，蔥(Alliumfistulosum)細胞質雄性不育與線粒體的氧化磷酸化有關(Liuetal.， 2016a)，芝麻(Sesamumindicum)雄性不育的形成是在乙烯和茉莉酸介導的信號通路以及NAC、WRKY 2類轉錄因子共同作用下形成的(Liuetal.， 2016b)，而卷心菜(Brassicaoleraceavar.capitata)細胞核雄性不育則主要涉及ATP合成酶(Guoetal.， 2016)。西瓜(Citrulluslanatus)(Rheeetal.， 2015)、辣椒(Capsicumannuum)(Liuetal.， 2013)等植物也有報道，但在木本植物中通過轉錄組數據分析對雄性不育相關基因進行研究尚未見報道。

本研究通過轉錄組測序技術，對楸樹雄性可育與不育花芽進行差異表達基因的分析，在基因轉錄水平上對楸樹雄性不育的機制進行探索，分析楸樹雄性不育發(fā)育過程中的特定基因的轉錄表達信息，以期為楸樹雄性不育機制的研究提供理論參考，同時也為重要性狀相關基因的克隆以及功能分析等奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 楸樹花芽采自河南洛陽虎頭山基地的楸樹植株，以自然突變的楸樹雄性不育花芽為試驗組，記為SL，以雄性可育花芽作為對照組，記為FL。試驗材料采集完成后立即用錫箔紙包好后做好標記用液氮處理，保存于-80 ℃冰箱中備用，轉錄組測序樣本每一組各取3個生物學重復，分別為SL-1，SL-2，SL-3和FL-1，FL-2，FL-3。

1.2 RNA提取 采用多糖多酚植物總RNA提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司)提取楸樹雄性不育花芽和雄性可育花芽總RNA。利用NanoDrop檢測RNA濃度，用Agilent 2100檢測28S/18S以及RIN值，同時使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測提取RNA的質量以及完整性。

1.3 轉錄組建庫及測序 提取樣品總RNA并使用DNaseⅠ消化DNA后，用帶有Oligo(dT)的磁珠富集真核生物mRNA； 加入打斷試劑在Thermomixer中適溫將mRNA打斷成短片段，以打斷后的mRNA為模板合成一鏈cDNA，再通過二鏈合成反應體系合成二鏈cDNA，并使用試劑盒純化回收、粘性末端修復、cDNA的3′末端加上堿基“A”并連接接頭，然后進行片段大小選擇，最后進行PCR擴增； 構建好的文庫用Agilent 2100 Bioanalyzer和ABI StepOnePlus Real-Time PCR System質檢，合格后使用Illumina HiSeq 4000或其他平臺進行測序。

1.4 測序讀長分析及拼接 測序所得數據稱為raw reads。首先，過濾掉低質量、接頭污染以及未知堿基N含量過高的reads，過濾后的數據稱為clean reads。對過濾后的數據使用Trinity進行De novo組裝得到Unigene，接下來使用Tgicl對轉錄本進行聚類去冗余得到Unigene。

1.5 Unigene的功能注釋、分類、代謝途徑分析以及表達量計算 使用Blast對Unigene進行NT、NR、COG、KEGG以及SwissProt注釋，使用Blast2GO以及NR注釋結果進行GO注釋，使用InterProScan 5進行InterPro注釋。在NT數據庫中比對分析非冗余核酸序列，利用NR、SwissProt數據庫分析蛋白序列，然后利用COG數據庫根據直系同源家族蛋白進行功能分類以及通過InterPro數據庫根據蛋白結構域進行家族分類以提供功能注釋。對所有Unigene基因在分子功能、細胞組分和生物過程進行GO功能分析以及在KEGG數據庫中進行代謝途徑的分析。然后使用RSEM計算各個樣品的基因表達水平。然后使用R軟件里的princomp函數進行PCA分析。

1.6 SL/FL庫中差異表達基因分析 根據需求，使用NOIseq和PossionDis方法進行差異基因檢測。NOIseq(參數： Fold Change ≥ 2.00； Probability ≥ 0.8)方法基于噪音分布原理，本試驗根據Tarazona等(2011)描述的方法進行差異表達基因(DEG)檢測。PossionDis(參數： Fold Change ≥ 2.00； FDR ≥ 0.001)方法基于泊松分布原理，本試驗根據Audic等(1997)中描述的方法進行DEG檢測。將得到的差異表達基因再進行單獨的聚類分析、GO功能分析、Pathway功能分析，并與已知雄性不育同源基因進行比對分析。

2 結果與分析

2.1 轉錄組測序以及功能注釋 使用Illumina Hiseq平臺對楸樹雄性可育花芽材料FL-1、FL-2、FL-3以及雄性不育材料SL-1、SL-2、SL-3進行轉錄組測序，共測得27.18 Gb原始數據。過濾掉原始數據中不合格的reads后，過濾后的clean reads Q20都達到了96.84%以上，每組數據質量見表1。對過濾后的數據使用Trinity進行de novo組裝，聚類去冗余得到Unigene，共得到86 076個Unigene。將得到的86 076個Unigene在7大功能數據庫進行注釋，注釋結果分布見表2，最終總共有64 600(75.05%)個Unigene得到注釋。

表1 過濾后的reads質量統(tǒng)計Tab.1 The filtered reads quality statistics

表1 過濾后的reads質量統(tǒng)計Tab.1 The filtered reads quality statistics

樣品Sample原始序列Totalrawreads/Mb有效序列Totalcleanreads/Mb有效堿基數Totalcleanbases/Gb有效讀數Q20CleanreadsQ20(%)有效讀數Q30CleanreadsQ30(%)有效讀數比例Cleanreadsratio(%)FL?145424529453971293139971FL?245414528453968492569972FL?345424530453975093869975SL?145424530453975294019973SL?245424530453974393779974SL?345364525453972493419975

① FL: 雄性可育花芽(對照組)； SL： 雄性不育花芽(試驗組)。Q20： 質量值大于20的堿基數目占總堿基數目的比例; Q30： 質量值大于30的堿基數目占總堿基數目的比例。FL： Male fertile flower buds(control group); SL: Male sterile flower buds(experimental group). Q20: The ratio of the number of bases having a quality value greater than 20 to the total number of bases; Q30:The ratio of the number of bases having a quality value greater than 30 to the total number of bases.

表2 Unigene功能注釋結果統(tǒng)計Tab.2 Unigene functional annotation statistical results

表2 Unigene功能注釋結果統(tǒng)計Tab.2 Unigene functional annotation statistical results

被注釋unigeneTheannotatedunigene總數Total數據庫DatabasesNrNtSwissprotKEGGCOGInterproGO總體Overall數目Number86076604695411242547372542578447203688364600百分比Percentage100%7025%6287%4943%4328%2995%5484%800%7505%

① Nr: Nr庫屬于非冗余蛋白序列數據庫，數據來源于GenPept, Swissprot, PIR, PDF, PDB以及NCBI RefSeq(ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/db); Nt: Nt庫屬于非冗余核酸序列數據庫，數據來源于GenBank, EMBL以及DDBJ(ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/db); SwissProt: UniProtKB/Swiss-Prot利用人工注釋，是一個高質量非冗余的蛋白數據庫(http://ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/swissprot); KEGG: KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)用于生物信息研究等，包括基因組、代謝組學等其他組學的數據分析(http://www.genome.jp/kegg); COG: 直系同源家族蛋白數據庫,根據系統(tǒng)發(fā)生進行分類(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG); InterPro: InterPro根據蛋白結構域進行家族分類以提供功能注釋(http://www.ebi.ac.uk/interpro); GO: Gene Ontology(GO)旨在開發(fā)一個計算方法來描述基因在分子、細胞和組織水平的功能體現(http://geneontology.org).

Nr: Nr library belongs to non redundant protein sequence databases, data from GenPept, Swissprot, PIR, PDF, PDB and NCBI RefSeq (ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/db); Nt: Nt library belongs to non redundant nucleic acid sequence database, data from GenBank, EMBL and DDBJ(ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/db); SwissProt: UniProtKB/SwissProt use manual annotation, is a high quality of non redundant protein database (http://ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/swissprot); KEGG: KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) is used for the study of biological information, etc., including genome, metabolomics, and other omics data analysis (http://www.genome.jp/kegg); GOG: A family of orthologous protein database, classified according to the system (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG); InterPro: According to the structure of protein domain family classification to provide functional annotation(http://www.ebi.ac.uk/interpro); GO: The Gene Ontology (GO) attempt to exploit a method to describe Gene in the function of the level of molecules, cells and tissues (http://geneontology.org).

圖1 差異表達基因統(tǒng)計結果Fig.1 The statistical results of differentially expressed genes

2.2 差異表達基因分析 采用Audic等(1997)的方法對3組測序的差異表達基因進行篩選，每組差異表達基因分布見圖1。差異表達基因定義為FDR(fail discovery rate)<0.001并且倍數差異在2倍以上的基因。楸樹雄性不育與雄性可育3組轉錄組測序結果分析獲得的差異表達基因數分別為26 149，27 320，23 466，差異上調表達基因分別有13 979，13 513，130 55個，差異下調表達基因分別有12 170，13 807，10 411個，3組測序篩選的結果相似。用噪音分布原理對楸樹雄性不育與雄性可育進行差異表達基因的篩選，差異表達基因為10 419個，表明這些差異基因與楸樹雄性不育的關系密切。在楸樹雄性不育花芽中，有3 504個差異基因(33.63%)在花芽組織中下調表達，有6 915個差異基因在花芽組織中上調表達(66.37%)。

圖2 差異表達基因GO聚類分析Fig.2 GO clustering analysis of Differentially expressed genes 1-20： 生物過程； 21-31:細胞組分； 32-43： 分子功能。 1.生物黏附； 2. 生物調節(jié)； 3. 組織或生物發(fā)生細胞組件； 4. 細胞過程； 5. 發(fā)育過程； 6. 生長； 7. 定位； 8. 細胞活動； 9. 代謝過程； 10. 多有機體進程； 11. 有機體多細胞進程； 12. 負調控生物過程； 13. 正調控生物過程； 14. 生物過程調節(jié)； 15. 生殖； 16. 生殖過程； 17. 應激反應； 18. 節(jié)律進程； 19. 信號傳導； 20. 單有機體進程； 21. 細胞； 22. 細胞連接； 23. 細胞成分； 24.細胞外區(qū)域； 25. 復雜大分子； 26. 膜； 27. 膜組件； 28. 附膜腔； 29. 細胞器； 30. 細胞器組分； 31. 共質體； 32. 抗氧化活性； 33. 結合活性； 34. 催化活性； 35. 電子載體活性； 36. 酶調節(jié)活性； 37. 分子轉導活性； 38. 核酸結合轉錄因子活性； 39. 養(yǎng)分貯液囊活性； 40. 蛋白結合轉錄因子的活性； 41. 受體活性； 42. 分子結構活性； 43. 轉錄活性。 1-20： Biological process; 21-31:Cellular component; 32-43： Molecular function. 1.Biological adhesion; 2. Biological regulation; 3. Cellular component organization or biogenesis; 4. Cellular process; 5. Developmental process; 6. Growth; 7. Localization; 8. Locomotion; 9. Metabolic process; 10.Multi-organism process; 11. Multicellular organismal process; 12. Negative regulation of biological process; 13. Positive regulation of biological process; 14. Regulation of biological process; 15. Reproduction; 16. Reproductive process; 17. Response to stimulus; 18. Rhythmic process; 19. Signaling; 20. Single-organism process; 21. Cell; 22. Cell junction; 23. Cell part; 24. Extracellular region; 25. Macromolecular complex; 26. Membrane; 27. Membrane part; 28. Membrane-enclosed lumen; 29. Organelle; 30. Organelle part; 31. Symplast; 32. Antioxidant activity; 33. Binding; 34. Catalytic activity; 35. Electron carrier activity; 36. Enzyme regulator activity; 37. Molecular transducer activity; 38. Nucleic acid binding transcription factor activity; 39. Nutrient reservoir activity; 40. Protein binding transcription factor activity; 41. Receptor activity; 42. Structural molecule activity; 43. Transporter activity.

2.3 差異表達基因的GO功能分析 對楸樹雄性不育以及可育的差異表達基因進行GO功能富集，圖2為差異表達基因GO聚類分析圖。發(fā)現富集在生物過程中的Unigene有2 329個，且富集較多的是代謝過程和細胞過程亞類； 富集在細胞組分中Unigene有1 538個，富集較多的2個亞類是細胞和細胞部分； 分子功能富集到的Unigene數為1 361，在該類中結合作用和催化活性2個亞類富集最多。顯著富集的(correctedP< 0.05) GO功能亞類9個(表3)，分子功能中的生長素外排膜轉運蛋白活性，生物過程中的種子休眠期的胚胎發(fā)育、種子發(fā)育、果實發(fā)育、繁殖器官結構的發(fā)育、繁殖系統(tǒng)的發(fā)育、體軸建成、生殖發(fā)育過程、繁殖過程。這些類別在楸樹雄性不育花芽組織中發(fā)揮了重要作用。

2.4 差異表達基因的KEGG通路分析 以楸樹雄性不育與雄性可育花芽組織的差異表達基因KEGG pathway聚類分析，差異表達基因映射到127個不同的生物途徑，顯著富集的Pathway (Q< 0.05)有42條(表4)，主要為： 代謝途徑、生物合成的次生代謝產物、剪接體、RNA轉運、內吞作用、甘油磷酸酯代謝、淀粉和蔗糖代謝、醚脂類代謝、苯丙素類生物合成等。這些途徑在楸樹雄性不育花芽組織中起重要調節(jié)作用。

2.5 雄性不育同源基因比對結果分析 根據同源性比對分析，最終共比對出246個Unigene。將得到的Unigene進行COG功能分類(圖3)，大多數都能夠在RNA加工和修飾，細胞周期控制、細胞分裂、染色體分區(qū)，轉錄中得到注釋，在信號轉導機制與復制、重組和修復中也有Unigene得到注釋。將比較分析后篩選得到的Unigene映射到代謝通路當中，最終多集中在丙酮酸代謝通路(圖4)以及與油菜素內酯(圖5)相關的代謝通路當中。在丙酮酸的代謝途徑中有丙酮酸轉化為草酰乙酸的途徑中(圖4加粗線條標示)富集結果最為顯著； 而在油菜素內酯的信號轉導途徑中，合成的油菜素內酯在對油菜素內酯不敏感相關受體激酶及油菜素內酯不敏感蛋白復合物(BRI1)的作用(圖5加粗框標示)過程中富集結果顯著。因此根據富集結果可以分析出丙酮酸代謝途徑和油菜素內酯信號轉導途徑對楸樹雄性不育的形成起著重要的作用。

3 討論

植物雄性不育的性狀是在雄蕊發(fā)育過程中由一系列極其復雜的與調控育性有關的基因在時間和空間上共同作用調控的。引起植物雄性不育主要與花粉形成過程中的調節(jié)基因有關，這些基因在植物花粉發(fā)育的各個過程，包括減數分裂異常(Zhouetal.， 2011； Nonomuraetal.， 2004)、胼胝質代謝異常(Wanetal.， 2011)、絨氈層發(fā)育異常(Jungetal.， 2005； Lietal.， 2006)、花粉壁發(fā)育異常(Shietal.， 2011)以及花藥開裂異常(Stintzi， 2000； Steiner-Langeetal.， 2003)等其他過程中都起著極其重要的作用。

表3 差異表達基因的GO功能顯著性富集可視化分析Tab.3 Visual analysis of differentially expressed genes which are significant enrichment by GO function

表4 差異表達基因在KEGG pathway顯著性富集可視化分析Tab.4 Visual analysis of differentially expressed genes which are significant enrichment by KEGG pathway

續(xù)表Continued

SL/FL通路項Pathwayterm差異基因通路注釋DEGswithpathwayannotation(5886)PQ通路位置PathwayID31丙酸代謝Propanoatemetabolism41(070%)389×10-3159×10-2ko0064032RNA轉運RNAtransport280(476%)405×10-3161×10-2ko0301333苯丙氨酸代謝Phenylalaninemetabolism56(095%)448×10-3173×10-2ko0036034內吞作用Endocytosis201(341%)651×10-3239×10-2ko0414435丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝Alanine，aspartateandglutamatemetabolism35(059%)658×10-3239×10-2ko0025036糖胺聚糖降解Glycosaminoglycandegradation24(041%)879×10-3310×10-2ko0053137抗壞血酸代謝Ascorbatemetabolism46(078%)926×10-3318×10-2ko0005338糖酵解和糖異生Glycolysis/Gluconeogenesis95(161%)103×10-2344×10-2ko0001039賴氨酸降解Lysinedegradation32(054%)107×10-2349×10-2ko0031040β-丙氨酸代謝Beta?alaninemetabolism34(058%)141×10-2440×10-2ko0041041甘油磷脂代謝Glycerophospholipidmetabolism189(321%)145×10-2440×10-2ko0056442谷胱甘肽代謝Glutathionemetabolism50(085%)146×10-2440×10-2ko00480

圖3 同源基因COG功能分類Fig.3 COG functional classification of homologous genesA. RNA加工和修飾； D. 細胞周期控制、細胞分裂、染色體分區(qū)； K. 轉錄； L. 復制、重組和修復； R. 一般功能預測； T. 信號傳導機制。A. RNA processing and modification; D. Cell cycle control, cell division, chromosome partitioning; K. Transcription; L. Replication, recombination and repair; R. General function prediction only; T. Signal transduction mechanisms.

眾所周知，可育花粉的形成與絨氈層的正常發(fā)育密切相關。絨氈層細胞發(fā)育異常將直接或間接導致花粉敗育。張博等(2015)發(fā)現，楸樹雄性不育的形成，是由于絨氈層出現高度液泡化，導致其提前解體。本研究結合差異表達基因的GO分析和Pathway分析以及同源基因的分析，尋找出與楸樹雄性不育有關的差異基因顯著富集通路。通過對差異表達基因的GO功能分析，楸樹的生殖過程、生殖發(fā)育過程、生殖系統(tǒng)發(fā)育、生殖結構發(fā)育均有顯著性富集，生長素流出跨膜轉運蛋白活性也顯著性富集。差異表達基因的Pathway顯著性分析表明，代謝途徑、次生代謝產物的生物合成、剪接體、RNA轉運及甘油磷脂、淀粉和蔗糖的代謝富集的差異基因數目較多。在同源基因的比對分析基礎上，將與已知相似度高的差異基因再次進行功能富集分析。最終顯著性富集結果主要映射在丙酮酸代謝以及植物激素信號轉導途徑中，這些分析為闡明楸樹雄性不育的調控途徑提供了線索。

GO分析結果表明楸樹雄性不育的形成與花發(fā)育過程中花繁殖器官的形成過程相關，才會形成不育的花粉。這個結果與本實驗室在細胞學上觀察的楸樹不育花粉的形成是絨氈層的發(fā)育異常相一致。Pathway通路分析表明楸樹雄性不育的形成與生化過程有著較為緊密的聯系。在已經報道的雄性不育與絨氈層發(fā)育相關的基因中，有一類基因屬于bHLH轉錄因子。這一類轉錄因子主要參與調控植物發(fā)育進程以及生化過程(Andradeetal.， 2014； Andriankajaetal.， 2014)； 而且這類轉錄因子表達異常后絨氈層也會出現高度液泡化(Zhangetal.， 2006； Jungetal.， 2005； Moonetal.， 2013； Liuetal.， 2014)。因此，在對差異基因Pathway分析結果做進一步的驗證時，應將潛在的bHLH轉錄因子當作進一步分析的對象。

圖4 丙酮酸參與相關代謝途徑Fig.4 Pyruvate involved in the metabolic pathways粗線條標示丙酮酸轉化為草酰乙酸的代謝途徑，丙酮酸→磷酸烯醇丙酮酸→草酰乙酸。The thick lines indicate the metabolic pathways of pyruvate conversion to oxaloacetate： Pyruvate→Phosphoenol-pyruvate→Oxaloacetate.

圖5 油菜素內酯相關信號轉導途徑Fig.5 Brassinosteroid related signal transduction pathways加粗框標示的BRI1為油菜素內酯不敏感蛋白1。BAK1: 油菜素內酯不敏感1受體激酶1; BKI1: 油菜素內酯不敏感蛋白1激酶抑制劑1； BSK: 油菜素內酯信號激酶； BSU1: 蘇氨酸蛋白磷酸酶激酶； BIN2: 油菜素內酯不敏感蛋白2； BZR1/2: 油菜素內酯耐受蛋白1/2； TCH4: 低聚木糖葡糖基轉移酶； CYCD3: 細胞周期蛋白D3。The BRI1 marked with the bold box is brassinosteroid insensitive protein 1. BAK1: Brassinosteroid insensitive 1 associated receptor kinase 1; BKI1:Brassinosteroid insensitive protein 1 kinase inhibitor 1; BSK: Brassinosteroid-signaling kinase; BSU1: Threonine-protein phosphatase; BIN2: Brassinosteroid insensitive protein 2; BZR1/2: Brassinosteroid resistant protein1/2; TCH4: Xyloglucosyl transferase; CYCD3: Cyclin D3.

在與雄性不育有關的同源基因的分析中，得到Unigene集中映射在丙酮酸代謝和油菜素內酯參與的信號轉導途徑中。丙酮酸在生物體的3大物質代謝過程中起著極其重要的作用。在丙酮酸的代謝途徑中，它可以通過乙酰CoA和重要的代謝途徑三羧酸循環(huán)實現3大物質的相互轉換。而一旦丙酮酸代謝異常就有可能對與生殖過程有關的包括減數分裂、絨氈層發(fā)育等途徑造成影響。丙酮酸參與的代謝網絡途徑復雜，但由丙酮酸到草酰乙酸的轉化這一過程得到顯著的富集。該過程也是生物體內糖代謝的關鍵步驟。植物激素轉導過程中，油菜素內酯的合成至關重要。油菜素內酯廣泛存在于包括花粉在內的許多花器官當中。在油菜素內酯參與調節(jié)的生物過程中，通過合成的油菜素內酯對油菜素內酯不敏感相關受體激酶和油菜素內酯不敏感蛋白復合物的作用，最終對DNA的轉錄表達產生影響，使得細胞伸長和細胞分裂出現異常從而影響花粉的正常形成。

結合本實驗室對楸樹雄性不育的細胞學觀察(張博等， 2015)以及對轉錄組數據的分析，對楸樹雄性不育得出一個初步的結果： 在楸樹花藥發(fā)育過程中，由于丙酮酸參與的代謝途徑出現異常，導致油菜素內酯合成途徑受到影響。合成的油菜素內酯是通過作用于細胞表面由BAK1和BRI1形成的復合物來進行信號轉導的。油菜素內酯合成異常，使得由BAK1和BRI1形成的復合物活性受到影響，導致參與調控細胞伸長和分裂的基因表達異常，從而使絨氈層細胞出現液泡化提前解體，楸樹小孢子在減數分裂時期出現異常，最終形成不育的花粉。楸樹的花粉敗育形成的雄性不育，在本試驗中已經有了初步的結論，但絨氈層異常形成的雄性不育，其形成過程十分復雜，只有通過更加深入的探索和研究才能對楸樹雄性不育的機制有更加清晰的了解。

4 結論

為了研究楸樹雄性不育形成的機制，對1株雄性不育的楸樹花芽和另1株正常發(fā)育的楸樹花芽進行轉錄組測序并對差異表達基因進行分析，結果顯示顯著性富集的差異表達基因多在與花的繁殖器官相關的途徑、重要的代謝途徑和與油菜素內酯相關的信號轉導途徑中。據此推斷可能是在花粉發(fā)育過程中，由于重要代謝途徑異常使得油菜素內酯的合成途徑出現變化最終導致絨氈層的不正常發(fā)育，使得小孢子減數分裂異常形成花粉敗育。本研究從轉錄水平初步分析了楸樹雄性不育的相關代謝途徑，獲得的有關結果對楸樹雄性不育的研究有著重要的參考價值。

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(責任編輯 徐 紅)

Transcriptome Sequencing and Analysis of Male SterileFlower Buds inCatalpabungei

Mao Weibing Chen Faju Wang Changlan Liang Hongwei

(BiotechnologyResearchCenter,ChinaThreeGorgesUniversityYichang443002)

【Objective】In order to reveal molecular mechanism ofCatalpabungeimale sterility from the gene expression levels, we analyze the regulation of gene expression patterns forC.bungeimale sterility by studying its natural mutation male sterile flower buds, in order to understand male sterility ofC.bungeiand other woody plants. 【Method】The transcriptome sequencing was carried out on male sterile and fertile flower buds. We use the method of comparative analysis to deal with the sterile and fertile bud transcript through bioinformatics, and predict and filter genes aboutC.bungeimale sterility. 【Result】Transcriptome sequencing produced a total of 27.18 Gb data. Finally, we obtained 86 076 Unigenes after assembling and removing redundant. Then we make use of the seven function databases (NR, NT, GO, COG, KEGG, Swissprot and Interpro) annotating all the Unigenes, a total of 64 600 (75.05%) Unigenes were eventually annotated by any one of the seven databases. Based on the analysis of expression levels of the Unigenes of the experimental group (male sterile flower buds, SL) and control group (male fertile flower buds, FL). Differently expressed genes with different expression levels and high reliability were screened out. In the noise distribution (expression levels differed over 2 times, reliability over 0.8), 6 915 up-regulated genes and 3 504 down-regulated genes were selected from the experimental group. Poisson distribution (expression levels differed over 2 times, incidence of errors under 0.001), in three biological repeats SL-1 vs FL-1, SL-2 vs FL-2, SL-3 vs FL-3 obtained up-regulated genes respectively of 13 979, 13 513 and 13 055 and down-regulated genes respectively of 12 170, 13 807 and 10 411. The GO functional analysis for differently expressed gene showed that the reproduction process, reproduction development process, reproduction system development, reproductive structure development in biological processes were significantly enriched. In molecular function the auxin efflux transmembrane transporter protein activity was significantly enriched. KEGG pathway analysis indicated that differently expressed genes were mapped to 127 different biological pathways. Those significantly enriched pathways mainly contain metabolic pathways, biosynthesis of secondary metabolites, spliceosome, RNA transport and metabolism of glycerophospholipid and starch and sucrose. By comparing differently expressed genes with these genes that are related to male sterility that have been reported, 246 highly homology Unigenes were distinguished. The COG function classification were more focused on RNA processing and modification, cell cycle control, cell division and chromosome partitions, transcription, etc. The differently expressed genes which were highly homology with the male sterility genes were mapped to the pyruvate metabolism, the plant hormone signal transduction pathway. 【Conclusion】 The formation of the male sterility forC.bungeiis involved in multiple processes of reproductive development, pyruvate metabolism pathway, the auxin efflux transmembrane transporter protein activity and brassinosteroid-mediated signal transduction path. Based on the analyses and relevant cytological observations that have been completed, we assume that the male sterility ofC.bungeiis possibly due to abnormal pyruvate metabolism process, leading to abnormal brassinosteroid synthesis and tapetum dysplasia which further affect the meiosis of microspores. These eventually resulted in the formation of sterile pollen.

Catalpabungei； male sterility； transcriptome sequencing； differentially expressed gene

10.11707/j.1001-7488.20170617

2016-07-25；

2016-11-02。

國家“十二五”科技支撐計劃課題(2012BAD21B03)； 三峽區(qū)域珍稀植物遺傳發(fā)育與種質創(chuàng)新重點實驗室(培育)開放基金項目(2016KBC07)。

S718.46

A

1001-7488(2017)06-0141-10

*梁宏偉為通訊作者。