哮喘患者支氣管肺泡灌洗液的差異蛋白表達(dá)及分析

趙蘊(yùn)偉 鄒曉婷 李爽

·呼吸病研究·

哮喘患者支氣管肺泡灌洗液的差異蛋白表達(dá)及分析

趙蘊(yùn)偉 鄒曉婷 李爽

目的 探討支氣管哮喘患者與健康人肺泡灌洗液(broncho alveolar lavage fluid，BALF)中蛋白質(zhì)表達(dá)的差異性，選出目標(biāo)上調(diào)蛋白。方法 選擇30例支氣管哮喘患者及30例健康志愿者，行支氣管肺泡灌洗，將灌洗液回收后離心、留取上清液后保存，應(yīng)用雙向凝膠電泳技術(shù)與質(zhì)譜技術(shù)對(duì)肺泡灌洗液行蛋白質(zhì)表達(dá)差異性的鑒定及分析。結(jié)果 支氣管哮喘組BALF的巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子(macrophagemigrat ioninhibitory factor,MIF)和嗜酸性粒細(xì)胞陽離子蛋白(eosinophil cationic pro-tein,ECP)含量明顯高于健康對(duì)照組(P<0.05),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論 MIF與ECP在哮喘肺泡灌洗液中是表達(dá)上調(diào)的蛋白，對(duì)支氣管哮喘的發(fā)生發(fā)展起到一定的促進(jìn)作用。

支氣管哮喘(bronchial asthma)，多以反復(fù)發(fā)作的喘息、氣促及胸悶為特點(diǎn)，是臨床的多發(fā)病、常見病，因其發(fā)病機(jī)制及臨床診治一直是醫(yī)學(xué)的重點(diǎn)和難點(diǎn)而受到廣大研究者的關(guān)注。目前研究認(rèn)為，哮喘跟許多炎癥細(xì)胞及炎癥因子有關(guān)，是一種以嗜酸性粒細(xì)胞為主的非特異性炎癥性疾病，其中，有涉及到大量蛋白質(zhì)的含量及種類變化，而支氣管肺泡灌洗液中的蛋白成分主要來源于氣道及肺泡上皮表層,在一定程度上，這些蛋白成分能反映哮喘發(fā)病的整個(gè)病理過程。本研究主要是以蛋白質(zhì)組學(xué)[1]為基礎(chǔ)，先用雙向凝膠電泳技術(shù)[2]得到標(biāo)本的電泳圖譜，然后應(yīng)用電泳圖譜分析軟件對(duì)其進(jìn)行匹配分析,同時(shí)對(duì)差異蛋白質(zhì)斑點(diǎn)的信息進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，最后用質(zhì)譜技術(shù)對(duì)其進(jìn)一步鑒定，選出新的生物學(xué)蛋白標(biāo)志物，為哮喘發(fā)病的機(jī)制提供新的線索，為支氣管哮喘的臨床診斷提供新的依據(jù)，并能為哮喘獲取新的治療靶點(diǎn)研究提供參考依據(jù)，從而為研究及診療支氣管哮喘帶來新希望。

資料與方法

一、本次實(shí)驗(yàn)收集2015年9月至2016年9月我院收治的30例哮喘患者為研究對(duì)象為觀察組，同時(shí)收集30例健康志愿者為對(duì)照組，兩組研究對(duì)象在種族、年齡、性別等一般性資料沒有顯著差異。選取支氣管哮喘患者的標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)中華醫(yī)學(xué)會(huì)呼吸病學(xué)分會(huì)哮喘學(xué)組在2008年制訂的支氣管哮喘防治指南[3]中確診為支氣管哮喘的患者，診斷這些患者在慢性緩解期，做支氣管鏡檢查之前，患者病情平穩(wěn)，年齡在20歲到60歲。選取病例時(shí)，排除標(biāo)準(zhǔn)如下：① 在急性發(fā)作期的患者;② 凝血功能較差的患者;③ 有妊娠、惡性腫瘤及嚴(yán)重的心肝腎疾病的患者;④ 合并自身免疫性疾病患者。所有患者及志愿者均簽署《經(jīng)電子支氣管鏡操作知情同意書》和《實(shí)驗(yàn)研究知情同意書》。

本次研究所需要應(yīng)用的主要試劑以及工具儀器主要有：購自Amersham Pharmaeia Bioteeh公司的三氯乙酸(TCA)、丙烯酰胺、瓊脂(Agarose)、溴酚藍(lán)，Bio-Rad公司的IPG緩沖液、TEMED、固相pH梯度預(yù)制膠條，80-1上海手術(shù)器械廠的離心機(jī)，美國的Bio-Rad laboratories凝膠成像儀，美國安發(fā)瑪西亞公司的雙向凝膠電泳儀，Amersham pharmcia Biotech公司的image Master TM 2D version:5.0圖像分析軟件，日本島津公司的質(zhì)譜儀。

二、方法

1 標(biāo)本采集：所有參加實(shí)驗(yàn)研究者均完成了心電圖、凝血功能，肝腎功能等常規(guī)檢查，在禁食8小時(shí)以后，清晨給予2%利多卡因局部吸入麻醉，兩小時(shí)后經(jīng)電子支氣管鏡行肺泡灌洗，收集所有的灌洗液置冰浴,1500prm離心30min,留取上清液，用1.5mL EP管分裝,標(biāo)記后儲(chǔ)存于-80℃冰箱中備用。

2 BALF中蛋白樣品的提取：采用三氯乙酸(TCA)沉淀法提取蛋白樣品。具體過程:分別取上述BALF樣品1.5lm,加入TCA0.15g,使樣品溶液的TCA終濃度為10%；充分混勻后冰浴20min,3500prm離心15min；棄除上清液,沉淀物以事先預(yù)冷的丙酮溶解,再次3500prm離心15min，將殘留的TCA和丙酮去除；蛋白沉淀物風(fēng)干幾分鐘后,加水化上樣緩沖液充分溶解,使樣品溶液中蛋白質(zhì)濃度為0.6mg/mL；4℃下,100000g離心60min去除雜質(zhì),上清液即為實(shí)驗(yàn)所需的BALF蛋白樣品, 置于-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

3 雙向凝膠電泳及凝膠圖像的分析： 此次實(shí)驗(yàn)研究將同組BALF樣本進(jìn)行等量混合，取300μL的BALF蛋白樣品，先除去BALF中的高豐度蛋白，再將其充分地進(jìn)行水化，將 ph 值為 3-10 的 17cm非線性膠條作為樣品，進(jìn)行第一向等電聚焦，等待其處于平衡之后，用硝酸銀對(duì)其進(jìn)行銀染后，開始用雙向凝膠電泳進(jìn)行第二向的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳[4]，染色后的雙向電泳凝膠用掃描儀透射掃描,將這些凝膠圖像逐一進(jìn)行點(diǎn)檢測(cè)，將它們的背景進(jìn)行削減與匹配，蛋白點(diǎn)豐度的比較在組間進(jìn)行，如果測(cè)到的蛋白點(diǎn)豐度高于或者是低于正常值的3倍，就把這類蛋白視作是差異蛋白。

4 質(zhì)譜檢測(cè)與數(shù)據(jù)庫檢索：將以上重復(fù)性比較好、形態(tài)相對(duì)完整的差異蛋白膠點(diǎn)進(jìn)行切取，萃取之后再用質(zhì)譜儀開始質(zhì)譜檢測(cè)與分析，最終得到一個(gè)肽質(zhì)量的指紋圖譜，將強(qiáng)度在10個(gè)單位以上、有10個(gè)以上離子信號(hào)的譜圖進(jìn)行數(shù)據(jù)庫檢索，鑒定出相關(guān)的多肽和蛋白。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用醫(yī)學(xué)統(tǒng)計(jì)軟件 SPSS 11.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析，實(shí)驗(yàn)中各種BALF蛋白質(zhì)含量變化的數(shù)據(jù)資料采用百分比表示，兩組數(shù)據(jù)間的樣本均數(shù)的比較采用配對(duì)資料t檢驗(yàn)，當(dāng)P<0.05 時(shí)，組間數(shù)據(jù)比較具有很大的差異。

結(jié) 果

進(jìn)行凝膠電泳技術(shù)和質(zhì)譜技術(shù)分析后的BLAF，電泳圖譜(見圖1)，共鑒定出相關(guān)9種差異表達(dá)的蛋白質(zhì)，這些蛋白斑點(diǎn)相對(duì)集中，其染色深淺及大小差異性較大，其中protein2(MIF)跟protein3(ECP)是研究的目標(biāo)蛋白，跟健康對(duì)照者相比，支氣管哮喘患者的移動(dòng)抑制因子和嗜酸性粒細(xì)胞陽離子蛋白豐度明顯較高，具有較大差異，P<0.05。具體差異蛋白含量的比較(見表1)。

圖1 聚丙烯酰胺凝膠電泳圖譜

組別nBALF中MIF值(ng/mL)BALF中ECP值(ng/mL)哮喘組3010.57±4.5320.68±5.23對(duì)照組304.58±1.546.79±2.36

注：P<0.05，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

討 論

目前認(rèn)為，哮喘的發(fā)病不僅受環(huán)境因素的影響，基因遺傳因素也起到了重要作用，并且可能與多種基因遺傳有關(guān)[5]。上個(gè)世紀(jì)以來,國際上將挑選哮喘候選基因一直視為重點(diǎn)，使得哮喘的分子遺傳學(xué)研究得到廣泛的關(guān)注，越來越多的臨床實(shí)驗(yàn)得到開展。遺傳信息的根本源頭是基因, 而蛋白質(zhì)才是生物體具體功能的執(zhí)行者。研究表明，蛋白質(zhì)的表達(dá)比基因序列在致病因素上更具有主導(dǎo)地位，跟其有關(guān)的疾病占所有疾病的98%，高出跟基因序列有關(guān)的疾病49倍。因此，在疾病的發(fā)病機(jī)制本質(zhì)上，異常表達(dá)的蛋白質(zhì)比基因更有揭示意義，本次實(shí)驗(yàn)正是在蛋白質(zhì)組學(xué)的基礎(chǔ)上，研究了哮喘患者與健康人的BALF中差異蛋白的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)MIF和ECP的蛋白豐度在哮喘患者中顯著升高。

哮喘是一種以多種炎癥細(xì)胞及炎癥因子為主的非特異性炎癥性疾病[6]，炎癥細(xì)胞在氣道內(nèi)聚集，釋放炎癥因子，導(dǎo)致粘液分泌增加，血管通透性增加，支氣管平滑肌收縮，引起哮喘的急性發(fā)病。MIF作為一種前炎癥因子,主要來源于嗜酸性粒細(xì)胞，哮喘患者M(jìn)IF的高表達(dá)，會(huì)引起嗜酸性粒細(xì)胞的產(chǎn)生增加，與嗜酸性粒細(xì)胞呈明顯正相關(guān)關(guān)系，因此MIF作為一種細(xì)胞因子，能明顯調(diào)節(jié)嗜酸性粒細(xì)胞的產(chǎn)生。MIF涉及到多方面的疾病，在免疫與炎癥等方面都有了很多的研究，將MIF作為靶點(diǎn)可以為哮喘的治療開辟新途徑。Yamaguchi[7]等研究了哮喘患者與健康對(duì)照者痰液中MIF的蛋白豐度,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在哮喘患者中，MIF的豐度明顯高于健康者,且跟嗜酸性粒細(xì)胞陽離子蛋白呈正相關(guān),該研究者還應(yīng)用雙重免疫熒光染色法進(jìn)一步證實(shí)了在痰液嗜酸性粒細(xì)胞胞液中，MIF與嗜酸性粒細(xì)胞過氧化酶共同存在。MIF能正向調(diào)控哮喘的細(xì)胞因子及炎性介質(zhì)，有學(xué)者[8]在基因敲除技術(shù)的基礎(chǔ)上，對(duì)哮喘大鼠模型進(jìn)行了相關(guān)研究,結(jié)果表明MIF基因敲除后的大鼠肺組織及肺泡灌洗液中IL-4、IL-5、IL-13等炎癥因子的含量明顯低于正常對(duì)照組,說明MIF有上調(diào)輔助性Th2優(yōu)勢(shì)性細(xì)胞因子的可能,在哮喘的發(fā)病過程中起到了促進(jìn)作用。Yamaguchi等[9]對(duì)有明顯喘息、氣促及咳嗽等癥狀的哮喘患者與處于緩解期的哮喘患者進(jìn)行了血清MIF的檢測(cè),結(jié)果顯示，有癥狀哮喘患者的MIF含量明顯高于無癥狀哮喘患者,因此說明，MIF與哮喘患者癥狀的發(fā)生有內(nèi)在的密切聯(lián)系。

ECP是一種堿性蛋白質(zhì)，在嗜酸性粒細(xì)胞中合成并分泌到細(xì)胞外，能導(dǎo)致氣道上皮的損傷及上皮細(xì)胞的脫落，抑制纖毛的異物清除作用，并釋放大量炎性介質(zhì)，ECP是哮喘發(fā)病過程的關(guān)鍵致病因子。Wever[10]等做了相關(guān)實(shí)驗(yàn)，研究顯示嗜酸性粒細(xì)胞陽離子蛋白(ECP)水平可以作為氣道炎癥活動(dòng)指標(biāo)之一,ECP引起炎癥的主要作用機(jī)制有：① 對(duì)氣管上皮細(xì)胞和角質(zhì)細(xì)胞有很強(qiáng)的毒性作用；② 誘導(dǎo)肥大細(xì)胞釋放組胺、白三烯、前列腺素、血栓烷素A2等炎性介質(zhì)，導(dǎo)致氣道粘液分泌增多，微血管及黏膜的通透性增加，黏膜充血水腫，并使感覺神經(jīng)纖維暴露，導(dǎo)致氣道高反應(yīng)性。

綜上所述，巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子和嗜酸性粒細(xì)胞陽離子蛋白作為嗜酸性粒細(xì)胞合成并分泌的蛋白質(zhì)，都可作為嗜酸細(xì)胞活性標(biāo)志物，能在支氣管哮喘的發(fā)生發(fā)展過程都起到重要的促進(jìn)及調(diào)節(jié)作用，因此，MIF和ECP的水平可反映哮喘氣道炎癥的活動(dòng)情況及疾病嚴(yán)重程度，可以為支氣管哮喘的臨床診斷及獲取新的治療靶點(diǎn)研究提供參考依據(jù)，具有較高的臨床應(yīng)用價(jià)值。

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黑龍江省科學(xué)技術(shù)研究面上項(xiàng)目(教育廳、校級(jí))，基金(No JMSUJCMS2016-041) 黑龍江省衛(wèi)生計(jì)生委科研課題(No 2016-299)

154007 黑龍江 佳木斯，佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院

李爽，E-mail：vivianlee1981@163.com

2017-02-15]