株洲地區北京基因型結核分枝桿菌感染與利福平耐藥的相關研究

譚英征 陳雙華 肖鵬程 李丹 傅京力 龍云鑄

株洲地區北京基因型結核分枝桿菌感染與利福平耐藥的相關研究

譚英征1陳雙華2肖鵬程1李丹1傅京力1龍云鑄1

目的 研究北京基因型結核分枝桿菌(MTB)感染的易感因素及其與利福平耐藥的相關性。 方法 收集株洲市2014年5月至2016年8月痰抗酸染色陽性肺結核患者156例痰標本，對MTB進行分離培養與菌種鑒定。培養陽性菌株行DNA提取，運用RD105缺失基因檢測法鑒定北京基因型MTB、Xpert MTB/RIF檢測法鑒定耐利福平MTB，分析性別、年齡、糖尿病、復治患者以及利福平耐藥與北京基因型的關系。結果 156例痰標本中培養出分枝桿菌150株，其中MTB菌株142株，非MTB菌株8株。女性患者的北京基因型MTB(38/68，55.8%)的比例明顯高于男性患者 (13/74，17.5%)，復治患者北京基因型MTB(26/55，47.2%)比例明顯高于初治患者(18/87，20.6%)，糖尿病患者北京基因型MTB(32/61，52.4%)比例明顯高于非糖尿病患者北京基因型MTB(19/81，23.4%)，年齡≥55歲的患者北京基因型MTB(31/60，51.6%)明顯高于年齡≤30歲的患者 (4/30，13.3%)，差異均有統計學意義(P<0.05)。在耐利福平菌株中北京基因型MTB(40/48，83.3%)明顯高于非耐利福平菌株中北京基因型MTB(11/94，11.7%)，差異有統計學意義(P<0.05)。結論 女性、高齡、并發糖尿病、復治，可能是感染北京基因型MTB的危險因素。北京基因型MTB與利福平耐藥有明顯相關性。

分枝桿菌，結核；RD105；利福平耐藥；Xpert MTB/RIF

結核病是嚴重危害人類健康的傳染病，是全球關注的公共衛生和社會問題，是我國重點控制的重大疾病之一。中國是全球結核病第二大高負擔國家[1]，年新發結核病患者例數約130萬[2]，患病人數僅次于印度，居全球第二，給社會造成嚴重的負擔。全世界有三分之一的結核病由北京基因型MTB引起。北京基因型菌株是一類具有相似遺傳背景的結核分枝桿菌，根據不同的基因特征，可將北京基因型家族成員進一步分為許多亞型，依次區分不同的北京家族株成員。這類菌株分布廣泛，在世界各地都發現有北京基因型菌株的流行，其致病性強、傳播迅速以及耐藥形成更容易[3-4]，多次造成爆發流行。但在世界不同地區北京基因型菌株的比列差距大，在中東、西歐、拉丁美洲等地區較低，在亞洲的東亞地區較高[5]。中國是一個結核病高發病率的國家，也是北京基因型菌株高比例的地區。在我國北方，北京基因型菌株占絕對優勢，可以達到70%-80%，在中國香港、中國臺灣所占比例分別為70%和44.5%[6-7]。它具有高毒力特點，引起抑制和逃逸宿主免疫，易致耐藥、結核復發。既往研究表明北京基因型菌株與結核耐藥有密切關系，但各地區研究結果不盡相同，本研究采用RD105缺失基因檢測法鑒定北京基因型MTB、Xpert MTB/RIF檢測法鑒定耐利福平結核分枝桿菌，探討株洲北京基因型MTB的流行情況、易感因素及與耐利福平結核分枝桿菌菌株的相關性。

資料與方法

一、對象

收集株洲市2014年5月至2016年8月到中南大學湘雅醫學院附屬株洲醫院結核門診就診患者為研究對象。該研究經中南大學湘雅醫學院附屬株洲醫院醫學倫理委員會批準，所有參與研究者均簽署知情同意書。入選患者156例，其中男82例，女74例，初治93例，復治63例，并發糖尿病61例，≤30歲33例，30-55歲54例，≥55歲69例。

1 入選標準：至少具有以下三項：① 有午后低熱、咳嗽、咯血、盜汗、乏力等典型肺結核感染臨床表現，癥狀超過2周；② 有肺結核典型影像學改變；③ 痰涂片抗酸染色陽性；④ 支氣管或肺部組織病檢支持結核性改變；⑤ 痰培養為結核分枝桿菌[8]。

2 排除標準：① 在外院已行菌種培養鑒定明確為耐多藥結核感染者；② 標本不合格者。

二、方法

1 痰抗酸染色法：收集患者清晨痰液，依據《中國結核病防治規劃實施工作指南(2008年版)》進行抗酸染色[9]，抗酸染色陽性痰液送羅氏培養。

2 羅氏固體培養：痰培養采用4%氫氧化鈉處理分離培養。吸取痰標本到前處理管中，加入4%氫氧化鈉前處理液充分混勻，靜置15min后取吸管吸取前處理液均勻接種在培養基斜面上，觀察培養情況，記錄生長結果[10-11]。

3 菌株DNA制備：將生長形態良好的菌體溶于500ulTE緩沖液(PH值為8.0)中，80℃、30min滅活，煮沸10min，1200r/min離心2min，取上清備用(-20℃冷凍保存)。

4 北京基因型MTB鑒定：北京家族菌株的鑒定采用RD105缺失基因檢測法。上游引物序列為RD105-P1 GGAGTCGTTGAGGGTGTTCATCAGCTCAGTCCGGT,下游引物序列為RD105-P2 CGCCAAGGCCGCATAGTCACGGTCG和RD105-P3 GGTTGCCCACTGGTCGATATGGTGGACTT。擴增條件：預變性94℃ 30s,57℃ 30s,72℃ 30s,25個循環后，72℃延伸7min。在1.5%瓊脂糖凝膠電泳下閱讀結果，擴增產物片段為786bp，該菌株為北京基因型；若擴增產物片段為1495bp，該菌株為非北京基因型[12]。

5 Xpert MTB/RIF檢測：取菌株標本與含氫氧化鈉及異丙醇的處理液混合，在渦旋震蕩器上震蕩15-30s，室溫靜置15min。取混合液2mL轉移至一次性多室塑料反應盒中，然后將反應盒放置到檢測模塊，儀器進行自動化分析[13]。

三、統計分析

采用SPSS18.0軟件進行統計分析，兩組間率的比較采用χ2檢驗分析，P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、菌株培養分型結果

從158例痰標本中培養出150株陽性菌株，MTB菌株142株，非MTB菌株8株。在142株MTB菌株中，北京基因型MTB 51例，非北京基因型91例。其中男74例，女68例，初治87例，復治55例，并發糖尿病61例，≤30歲30例，30-55歲52例，≥55歲60例(見表1)。

表1 142例MTB菌株分型結果(例)

二、北京基因型MTB的易感因素

女性患者的北京基因型MTB(38/68，55.8%)明顯高于男性患者的北京基因型MTB(13/74，17.5%)，復治患者北京基因型MTB(26/55，47.2%)明顯高于初治北京基因型MTB(18/87，20.6%)，糖尿病患者北京基因型MTB(32/61，52.4%)明顯高于非糖尿病患者北京基因型MTB(19/81，23.4%)，年齡≥55歲的患者北京基因型MTB(31/60，51.6%)明顯高于年齡≤30歲的患者北京基因型MTB(4/30，13.3%)，差異均有統計學意義(P<0.05)。

三、北京基因型MTB與耐利福平的關系

通過Xpert MTB/RIF檢測結果發現，耐利福平菌株48例，其中北京基因型MTB40例，非北京基因型8例。耐利福平患者北京基因型MTB(40/48，83.3%)明顯高于非耐利福平患者北京基因型MTB(11/94，11.7%)，差異均有統計學意義，P<0.05。(見表2)。

表2 142例MTB菌株Xpert MTB/RIF檢測結果分析(例)

討 論

北京基因型MTB在世界各地流行廣泛，不同地域差別明顯，在亞洲較為流行。它與多耐藥密切相關，被懷疑是獲得耐藥性優勢的進化譜系。一旦有一株耐多藥，治療就變得困難、復雜，且更易造成結核傳染播散[14]。因此，研究北京基因型菌株的分布和傳播規律，探討其與耐藥的相關性，對結核病的控制具有重要意義。

RD105缺失基因檢測法是一種基于結核分枝桿菌復合群長片段序列多態性(large sequence polymorphisms，LSPs)分析對北京家族菌株進行鑒定的新方法[15-16]。該方法操作簡便、快速、費用低廉，且準確可靠，為北京基因型進行鑒定的篩選方法[17]。本研究釆用RD105缺失基因檢測法鑒定北京家族菌株，在142株MTB菌株中，北京基因型MTB 51例，非北京基因型61例。北京基因型MTB所占比例為35.9%，低于我國北方、香港、臺灣，提示北京基因型MTB在地區發布有一定的差異性，但樣本量較少，不能進行有效統計學分析。本次研究中女性患者的北京基因型MTB(38/68，55.8%)明顯高于男性患者的北京基因型MTB(13/74，17.5%)，復治患者北京基因型MTB(26/55，47.2%)明顯高于初治北京基因型MTB(18/87，20.6%)，糖尿病患者北京基因型MTB(32/61，52.4%)明顯高于非糖尿病患者北京基因型MTB(19/81，23.4%)，年齡≥55歲的患者北京基因型MTB(31/60，51.6%)明顯高于年齡≤30歲的患者北京基因型MTB(4/30，13.3%)，差異均有統計學意義(P<0.05)。提示女性、高齡、復治患者、并發糖尿病患者可能是感染北京基因型MTB的易感因素，可能為宿主免疫反應低下，不足以刺激Th1細胞及阻止細菌的大量繁殖，導致宿主易感。

Xpert MTB/RIF檢測法是世界衛生組織為遏制結核病推薦的檢驗方法[18]，是以半巢式實時定量PCR技術為基礎，以rpob基因為靶基因，自動提取DNA后擴增rpob基因的81bp片段進行檢測，2小時內可檢測出MTB是否對利福平耐藥[19-22]。由于大部分利福平耐藥菌株同時對異煙肼耐藥，故利福平耐藥情況可以在一定程度上可作為耐多藥結核病的監測指標。通過Xpert MTB/RIF檢測結果發現，耐利福平菌株48例，其中北京基因型MTB 40例，非北京基因型8例。耐利福平患者北京基因型MTB(40/48，83.3%)明顯高于非耐利福平患者北京基因型MTB(11/94，11.7%)，差異均有統計學意義(P<0.05)。北京基因型MTB被認為是獲得耐藥性優勢的進化譜系，與耐藥相關密切，但不同國家和地區各不同。本次研究中，耐利福平患者北京基因型MTB(40/48，83.3%)明顯高于非耐利福平患者北京基因型MTB(11/94，11.7%)，差異均有統計學意義。而耐利福平患者大多數情況下伴隨耐異煙肼，很少有單獨耐利福平的報道。研究北京基因型MTB對耐藥結核病傳播有重要的意義，本研究提示北京基因型MTB對株洲地區耐藥結核的流行有著重要的意義，可能是耐藥結核病傳播的優勢菌群，應重視并做好流行病學追蹤。本次研究運用現場流行病學和分子生物學方法分析了株洲北京基因型結核分枝桿菌菌株的流行情況和與耐利福平結核分枝桿菌菌株的相關性，為株洲耐藥結核病的防治提供參考依據，并對耐藥結核病人群的監測具有重要意義。但由于結核病具有潛伏感染的特點，其發病和傳播具有復雜性，北京基因型MTB的耐藥機理、體內感染機制、流行病學特點等問題目前仍尚不清楚，需要進一步的大樣本研究。

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Correlative research between Beijing genotypes MTB infection in Zhuzhou and rifampin resistance

TAN Ying-zheng, CHEN Shuang-hua, XIAO Peng-cheng, LI Dan, FU Jing-li, LONG Yun-zhu

Department of Infections Diseases, Zhuzhou Affiliated Hospital of Xiangya Medical College of Central South University, Zhuzhou, Hunan 412007, China

Objective To explore the correlation between Beijing genotypes MTB infection in Zhuzhou and rifampin resistance. Methods 156 sputum specimens of tuberculosis with positive sputum anti-acid stain were collected from May 2014 to August 2016 in Zhuzhou, and they were given isolated culture and strain identification. The positive strains were given DNA extract, and Beijing genotypes MTB was identified by RD105 missing genetic test and rifampin resistance of MTB by Xpert MTB/test so as to analyze the association of Beijing genotypes with gender, age, diabetes, retreatment patients and rifampin resistance. Results 150 mycobacterium were cultivated among 156 sputum specimens, wherein there were 142 MTB strains and 8 non-MTB strains. The proportion of Beijing genotypes MTB of female patients (38/68, 55.8%) was apparently higher than that of male patients (13/74, 17.5%), and the proportion of Beijing genotypes MTB of retreated patients (26/55, 47.2%) was apparently higher than that of untreated patients (18/87, 20.6%), and the proportion of Beijing genotypes MTB of diabetes patients (32/61, 52.4%) was apparently higher than that of non-diabetes patients (19/81, 23.4%), and the proportion of Beijing genotypes MTB of patients over 55 years old (31/60, 51.6%) was apparently higher than that of patients below 30 (4/30, 13.3%) (P<0.05). Beijing genotypes MTB in rifampin-resistance strains (40/48, 83.3%) was obviously higher than that in non-rifampin resistance strains (11/94, 11.7%) (P<0.05). Conclusion Female, advanced age, diabetes and retreatment might be the risk factors of Beijing genotypes MTB infection. Beijing genotypes MTB is obviously associated with rifampin resistance.

Mycobacterium; tuberculosis; Rd105; rifampin resistance; Xpert MTB/RIF

10.3969/j.issn.1009-6663.2017.08.040

1. 412007 湖南 株洲，中南大學湘雅醫學院附屬株洲醫院，感染內科 2. 412012 湖南 株洲，湖南中醫藥高等專科學校

龍云鑄，E-mail:346370009@qq.com

2016-11-24]