陰性免疫磁珠富集法富集非小細(xì)胞肺癌患者循環(huán)腫瘤細(xì)胞及相關(guān)性研究

湯井嬌 劉清菁 劉亮 胡晨曦 惠開元 蔣曉東

陰性免疫磁珠富集法富集非小細(xì)胞肺癌患者循環(huán)腫瘤細(xì)胞及相關(guān)性研究

湯井嬌1劉清菁1劉亮1胡晨曦2惠開元2蔣曉東1

目的 對非小細(xì)胞肺癌患者進(jìn)行CTC檢測，探討CTC檢測結(jié)果與非小細(xì)胞肺癌患者臨床特征的相關(guān)性，評價其臨床意義。方法 采用免疫磁珠陰性富集法和FISH技術(shù)檢測循環(huán)腫瘤細(xì)胞。取CTC≥4為臨界值，通過卡方檢驗與Fisher確切概率法分析CTC水平與臨床特征的關(guān)系。結(jié)果 85例非小細(xì)胞肺癌患者CTC陽性率 62.4%，Ⅰ期陽性率37.5%，Ⅱ期陽性率75%，Ⅲ期陽性率48.4%，Ⅳ期陽性率76.2%，Ⅰ-Ⅳ期陽性率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.016)；與相關(guān)腫瘤標(biāo)志物CEA、CYFRA-21、CA125等是否升高無明顯相關(guān)性(P=1, 1, 0.405，F(xiàn)isher確切概率法)。結(jié)論 CTC與腫瘤分期密切相關(guān)，分期越晚的患者CTC陽性率越高，腫瘤標(biāo)志物是否升高對CTC陽性率沒有影響。

非小細(xì)胞肺癌；循環(huán)腫瘤細(xì)胞；TNM分期；腫瘤標(biāo)志物

肺癌是威脅人類生命健康的頭號癌癥殺手，全球肺癌的患病率和死亡率在逐年上升。非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)在肺癌中所占的比例約80%-85%，五年生存率僅為15-20%[1]。70%的NSCLC患者在確診時已經(jīng)發(fā)生了遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是NSCLC患者死亡的主要原因[2]。傳統(tǒng)的放射學(xué)檢查方法如CT、MRI等往往是對已經(jīng)發(fā)生轉(zhuǎn)移且轉(zhuǎn)移灶達(dá)到一定體積大小的患者具有監(jiān)測作用[3]，因此在遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移發(fā)生之前或者疾病早期監(jiān)測到轉(zhuǎn)移的可能性并實施相應(yīng)的治療干預(yù)措施成為降低患者死亡率的重要手段。腫瘤的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移主要通過循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cells，CTC)的形式實現(xiàn)，CTC是指自發(fā)由原發(fā)灶或轉(zhuǎn)移灶脫落或因診療操作脫落進(jìn)入外周血循環(huán)的腫瘤細(xì)胞，在一定條件下可以形成轉(zhuǎn)移灶[4]。CTC檢測能夠在轉(zhuǎn)移發(fā)生之前或者早期起到監(jiān)測的作用。許多研究發(fā)現(xiàn)CTC是腫瘤患者的重要預(yù)后因子，與腫瘤患者的無進(jìn)展生存期(progression free survival，PFS)、總生存率(overall survival，OS)具有明顯的相關(guān)性[5-8]，放化療療程期間進(jìn)行CTC檢測可以一定程度反應(yīng)治療效果[9]，CTC聯(lián)合常見的腫瘤標(biāo)志物如CEA可以作為很好的NSCLC的預(yù)后指標(biāo)。目前CTC與NSCLC患者臨床特征之間的相關(guān)性還沒有明確，本研究擬通過回顧性研究方法，采用陰性免疫磁珠富集和免疫熒光原位雜交法(FISH)檢測NSCLC患者的CTC水平，分析CTC與NSCLC患者的臨床特征之間的關(guān)系。

資料與方法

一、臨床資料

收集2015年8月至2016年2月在連云港市第一人民醫(yī)院腫瘤實驗室行CTC檢測的NSCLC患者85例的臨床資料，所有患者均由組織病理學(xué)確診為NSCLC，且檢測前未接受任何抗腫瘤治療，14例健康體檢者作為對照組。85例NSCLC組患者中位年齡59(41-78)歲。其中男性49例、女性36例；鱗癌21例、腺癌64例。Ⅰ期患者8例、Ⅱ期患者4例、Ⅲ期患者31例、Ⅳ期患者42例；同時檢查腫瘤標(biāo)志物及CTC的患者42例。(見表1)。

表1 非小細(xì)胞肺癌患者的特征

ADC*: 腺癌. SCC*: 鱗狀細(xì)胞癌

二、循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC)檢測

檢測系統(tǒng)采用萊爾(北京)醫(yī)療器械有限公司循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測系統(tǒng)的免疫磁珠陰性富集法，檢測試劑采用其配套試劑。

1 樣本采集：對病人進(jìn)行嚴(yán)格消毒后，采集肘正中靜脈血5mL，室溫(15-30℃)保存，于采集后的24h 內(nèi)富集腫瘤細(xì)胞。

2 白細(xì)胞去除、稀有細(xì)胞富集：稀釋全血，離心去除血紅蛋白等蛋白類；裂解紅細(xì)胞，離心去除紅細(xì)胞裂解后釋放的基質(zhì)，沉淀下來的即白細(xì)胞和稀有細(xì)胞；洗滌磁微粒，加入處理好的血樣本于表面包被特殊抗體的磁珠，使磁珠與白細(xì)胞充分結(jié)合；離心，利用梯度密度離心原理將掛有磁珠的白細(xì)胞沉淀在最底層，有效去除磁珠；再次稀釋、濃縮體積；再次去除殘余的磁珠(白細(xì)胞)；離心、棄上清、加入固定液，混勻涂片。風(fēng)干至完全干燥。

3 免疫熒光原位雜交(FISH) ：固定液固定標(biāo)本，將離心好的8號染色體著絲粒探針(chromosome 8 centromere probe,CEP8)加入標(biāo)本區(qū)，加蓋玻片封片；標(biāo)本放入雜交儀進(jìn)行雜交，探針與著絲粒結(jié)合，雜交好的標(biāo)本進(jìn)行洗片、洗滌操作。配置CD45-AF594(白細(xì)胞共同抗原-Alexa Flour594熒光染料)抗體工作液，洗片、抗體加至標(biāo)本區(qū)孵育，復(fù)洗片；使用4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)復(fù)染標(biāo)本，蓋片避光保存。

4 由工作人員在熒光顯微鏡下進(jìn)行最終判讀，判讀標(biāo)準(zhǔn)：陽性細(xì)胞：FISH陽性(信號≥3，40倍鏡下不分層)， CD45陰性，細(xì)胞核為單個。(見圖1)。

圖1 在40倍熒光顯微鏡下觀察FISH染色結(jié)果

A：紅色表示細(xì)胞表面的CD45；B：黃色陽性點(diǎn)為CEP-8；C：藍(lán)色表示細(xì)胞核；D：FISH陽性(信號≥3，40倍鏡下不分層)，CD45陰性，細(xì)胞核為單個、無分裂代表腫瘤細(xì)胞。

三、統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS16.0 統(tǒng)計軟件包進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。 計數(shù)資料采用χ2檢驗或Fisher確切概率檢驗，采用雙側(cè)檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、CTC在不同性別年齡、不同分期、不同病理類型的肺癌患者中陽性率情況

目前尚無國際標(biāo)準(zhǔn)化的 CTC陽性判定標(biāo)準(zhǔn)，本研究按照試劑盒說明書取CTC≥4為陽性。85例肺癌患者中，CTC檢出數(shù)值范圍為0-27個，中位檢出數(shù)目為3個，陽性率為62.4%(53/85)，(見圖1)。14例健康體檢者陽性率為14.3%(2/14)，NSCLC患者與健康體檢者CTC陽性率差別有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=11.284，P=0.001)；性別陽性率差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.43，P=0.512)；Ⅰ-Ⅳ期陽性率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=15.654，P=0.016)；腺癌、鱗癌陽性率差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.191，P=0.662)；T分期陽性率差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.461，P=0.927)；N分期陽性率差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.706，P=0.802)； M分期陽性率差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=3.517，P=0.061)。(見表2)。

表2 非小細(xì)胞肺癌患者臨床病理特征與CTC計數(shù)關(guān)系分析

ADC*: 腺癌. SCC*: 鱗狀細(xì)胞癌. TNM: 腫瘤 淋巴結(jié) 遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移

二、肺癌患者腫瘤標(biāo)志物與CTC檢出之間的關(guān)系

CEA升高組與正常組CTC陽性率差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(Fisher確切概率法，P=1)； CYFRA21-1升高組與正常組CTC陽性率差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(Fisher確切概率法，P=1)；CA125升高組與正常組CTC陽性率差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(Fisher確切概率法，P=0.405)。(見表3)。

表3 非小細(xì)胞肺癌患者腫瘤標(biāo)志物與CTC計數(shù)的關(guān)系

討 論

遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是NSCLC患者死亡的主要原因，即使已行大范圍手術(shù)切除的早期肺癌患者仍有25%-50%復(fù)發(fā)風(fēng)險，因此尋找較放射性檢查及組織活檢重復(fù)性強(qiáng)、無創(chuàng)性、更靈敏的、能夠發(fā)現(xiàn)潛在轉(zhuǎn)移風(fēng)險的檢測方法非常必要，CTC檢測的出現(xiàn)實現(xiàn)了這一可能[10-11]。選擇適合的CTC檢測方法即為關(guān)鍵步驟。婁加陶等[12]將常見的CTC檢測方法分為標(biāo)記法和非標(biāo)記法。標(biāo)記法包括目前應(yīng)用最廣泛的CellSearch系統(tǒng)，該法對上皮類的腫瘤如乳腺癌、前列腺癌、直腸癌的檢出率較高，但是轉(zhuǎn)移過程中上皮表型EpCAM、CK等的表達(dá)會下降或缺如[13]，導(dǎo)致敏感性下降。非標(biāo)記法包括上皮腫瘤細(xì)胞大小分離法(isolation by size of epithelial tumor cell, ISET),該方法保持了細(xì)胞的完整狀態(tài)，便于后續(xù)細(xì)胞及基因組分析[13]，但CTC具有大小及變形性等異質(zhì)性，因此很難達(dá)到統(tǒng)一的檢測流程和質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)[12]。同時還有以RT-PCR為基礎(chǔ)的技術(shù)，此技術(shù)較優(yōu)應(yīng)用于基因組分析，但限制了CTC計數(shù)及形態(tài)學(xué)分析[10]。本研究采用陰性免疫磁珠富集法聯(lián)合FISH進(jìn)行CTC計數(shù)，陰性免疫磁珠富集法富集的腫瘤類型更多，同時應(yīng)用FISH方法敏感性較高，便于應(yīng)用于臨床檢測。本研究發(fā)現(xiàn)NSCLC患者不同性別、年齡、病理分型的CTC陽性率差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義，而不同分期的陽性率差異有統(tǒng)計學(xué)意義，表明CTC水平與腫瘤分期具有相關(guān)性。這與Wan等[14]的研究結(jié)果相同。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)臨床分期是NSCLC最重要的預(yù)后因子，在早期病例中重要的預(yù)后因子還有年齡和性別[15-16]。本研究未發(fā)現(xiàn)性別、性別與CTC的相關(guān)性，可能與種族特異性、病因不同等原因有關(guān)[17]。

常見的腫瘤標(biāo)志物如CEA、CA125、CYFRA21-1等在NSCLC患者的預(yù)后及評價治療效果的重要價值已被多個實驗研究證實[18-19]。研究腫瘤患者CTC與腫瘤標(biāo)志物的關(guān)系，對了解CTC在腫瘤預(yù)后及治療中的指標(biāo)作用具有重要意義。與常規(guī)的腫瘤標(biāo)志物相比，CTC檢測在腫瘤的早期階段也可以被發(fā)現(xiàn)，有研究發(fā)現(xiàn)早期肺癌患者CTC檢出率達(dá)68%[11]。本研究Ⅰ-Ⅱ期患者CTC檢出率為50%(6/12),證明了早期階段的NSCLC患者亦能檢出CTC的存在。Yu等[20]使用葉酸受體陽性檢測法檢測NSCLC患者的CTC，發(fā)現(xiàn)該法相比于腫瘤標(biāo)志物CEA、CA125、NSE、CYFRA21-1、SCC等具有更高的診斷有效率。鞏平等[21]發(fā)現(xiàn)NSCLC患者的CTC陽性率與CYFRA21-1、LDH水平明確相關(guān)。本研究結(jié)果顯示腫瘤標(biāo)志物CEA、CYFRA21-1、CA125與CTC的陽性率無相關(guān)性，不能明確兩者之間是否具有關(guān)聯(lián)性。需進(jìn)一步加大樣本量，對患者隨訪研究，了解CTC在NSCLC預(yù)后及治療中的作用。

隨著腫瘤精準(zhǔn)治療的開展，除了進(jìn)一步明確CTC在NSCLC的預(yù)后及評價治療療效的作用，還應(yīng)著眼于CTC基因組水平的研究。CTC異質(zhì)性的存在，可能是免疫逃逸及化療耐藥產(chǎn)生的原因之一，建立CTC細(xì)胞系，了解不同CTC細(xì)胞的分子特征及基因表型，為腫瘤靶向治療帶來新思路。

[1] American Cancer Society. Cancer Facts & Figures 2015[R].Atlanta:American Cancer Society,2015.

[2] Mehlen P,Puisieux A.Metastasis: a question of life or death[J].Nat Rev Cancer,2006,6(6):449-458.

[3] National Lung Screening Trial Research Team. Reduced Lung-Cancer Mortality with Low-Dose Computed Tomographic Screening[J].N Engl J Med, 2011,365(5):395-409.

[4] Brouwer A,De Laere B,Peeters D,et al.Evaluation and consequences of heterogeneity in the circulating tumor cell compartment[J].Oncotarget,2016,7(30):48625-48643.

[5] Bidard F-C,Peeters DJ,Fehm T,et al.Clinical validity of circulating tumour cells in patients with metastatic breast cancer: a pooled analysis of individual patient data[J].Lancet Oncol,2014,15(4):406-414.

[6] Rud AK,Borgen E,M?landsmo GM,et al.Clinical significance of disseminated tumour cells in non-small cell lung cancer[J].Br J Cancer,2013,109(5):1264-1270.

[7] Han L,Chen W,Zhao Q.Prognostic value of circulating tumor cells in patients with pancreatic cancer: a meta-analysis[J].Tumour Biol,2014,35(3):2473-2480.

[8] Nichols AC,Lowes LE,Szeto CC,et al.Detection of circulating tumor cells in advanced head and neck cancer using the CellSearch system[J].Head Neck,2012,34(10):1440-1444.

[9] Onstenk W,de Klaver W,de Wit R,et al.The use of circulating tumor cells in guiding treatment decisions for patients with metastatic castration-resistant prostate cancer[J].Cancer Treat Rev,2016,46:42-50.

[10] 陳鵬，李雷.非小細(xì)胞肺癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測進(jìn)展[J].中國腫瘤臨床，2013,40(14):862-865.

[11] Tanaka F,Yoneda K,Kondo N,et al.Circulating Tumor Cell as a Diagnostic Marker in Primary Lung Cancer[J].Clin?Cancer?Res,2009,15(22):6980-6986.

[12] 吳飛，婁加陶.循環(huán)腫瘤細(xì)胞在肺癌診治中的應(yīng)用[J].中華檢驗醫(yī)學(xué)雜志，2013，36(11)：983-986.

[13] Tognela A,Spring KJ,Becker T,et al.Predictive and prognostic value of circulating tumor cell detection in lung cancer: a clinician's perspective[J].Crit Rev Oncol Hematol，2015,93(2):90-102.

[14] Wan JW,Gao MZ,Hu RJ,et al.A preliminary study on the relationship between circulating tumor cells count and clinical features in patients with non-small cell lung cancer[J].Ann Transl Med,2015,3(22):352.

[15] Siegel R,Naishadham D,Jemal A.Cancer statistics,2013[J].CA Cancer J Clin,2013,63(1):11-30.

[16] Alama A,Truini A,Coco S,et al.Prognostic and predictive relevance of circulating tumor cells in patients with non-small-cell lung cancer[J].Drug Discov Today,2014,19(10):1671-1676.

[17] Chen X,Wang X,He H,et al.Combination of circulating tumor cells with serum carcinoembryonic antigen enhances clinical prediction of non-small cell lung cancer[J].PLoS One,2015,10(5):e0126276.

[18] Grunnet M,Sorensen JB.Carcinoembryonic antigen (CEA) as tumor marker in lung cancer[J].Lung cancer,2012, 76(2):138-143.

[19] Szturmowicz M,Rudzinski P,Kacprzak A,et al.Prognostic value of serum C-reactive protein (CRP) and cytokeratin 19 fragments (Cyfra 21-1) but not carcinoembryonic antigen (CEA) in surgically treated patients with non-small cell lung cancer[J].Pneumonol Alergol Pol,2014,82(5):422-429.

[20] Yu Y,Chen Z,Dong J,et al.Folate Receptor-Positive Circulating Tumor Cells as a Novel Diagnostic Biomarker in Non-Small Cell Lung Cancer[J].Transl Oncol,2013,6(6):697-702.

[21] 劉春花，楊政， 李娜,等.循環(huán)腫瘤細(xì)胞與肺癌臨床病理特征的關(guān)系[J].重慶醫(yī)學(xué)，2014，43(20):2565-2568.

Correlation research between CTC detection and clinical characteristics of NSCLC patients by negative immunomagnetic beads enrichment

TANG Jing-jiao, LIU Qing-jing, LIU Liang, HU Chen-xi, HUI Kai-yuan, JIANG Xiao-dong

Department of Radiation Oncology, Lianyungang Affiliated Hospital of Xuzhou Medical University, Lianyungang, Jiangsu 222002, China

Objective To explore the relationship between CTC counts and characteristics of NSCLC patients. Methods It used negative enrichment of immune magnetic beads and FISH to detect CTCs, and its cut-off value was defined as 4. Data were analyzed by Chi-square test and Fisher’s exact test. Results The positive rate of 85 NSCLC patients were 62.4%. The positive rate of stageⅠ, stage Ⅱ, stage Ⅲ and stage Ⅳ were 37.5%, 75%, 48.4% and 76.2%, respectively (P=0.016). No correlation was found between CTC counts and tumor markers CEA, CYFRA-21 and CA125 (P=1, 1, 0.405) (Fisher’s exact text). Conclusion Different stages of NSCLC patients have different CTC levels. The advanced clinical stage has the higher positive rate, and the levels of tumor markers have no effect on the positive rate of CTC.

non-small cell lung cancer; circulating tumor cell; TNM staging; tumor markers

10.3969/j.issn.1009-6663.2017.08.037

222002 江蘇 連云港，徐州醫(yī)科大學(xué)附屬連云港醫(yī)院1.腫瘤放療科、2.腫瘤實驗室

2016-12-13]