TRALI大鼠肺泡活化巨噬細胞及共刺激分子CD40、ICAM-1的表達變化分析

饒群 朱宇芳 黃華

TRALI大鼠肺泡活化巨噬細胞及共刺激分子CD40、ICAM-1的表達變化分析

饒群1朱宇芳1黃華2

目的 探討輸血相關急性肺損傷(TRALI)大鼠肺泡活化巨噬細胞及共刺激分子CD40、血漿及肺組織中細胞間粘附分子-1(ICAM-1)的表達變化及其意義。方法 選取60只SPF級、6-7周齡的雄性SD大鼠，采用隨機數字表法分為假手術組(腹腔注射等量生理鹽水)、對照組(腹腔注射2mg/kg脂多糖)、模型組(靜脈輸注脂多糖5mg/kg)和TRALI組(腹腔注射2mg/kg脂多糖+靜脈輸注血漿1mL/只)各15只，采用RT-PCR技術檢測活化巨噬細胞中Toll樣受體4(TLR4)mRNA的表達，采用Northern bolt 檢測CD40 mRNA的表達，采用免疫組化染色檢測ICAM-1蛋白的表達，采用酶聯免疫吸附法(ELISA)檢測血清中腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素-1β(IL-β)、ICAM-1的水平。結果 模型組和TRALI組的活化巨噬細胞中TLR4 mRNA、肺組織中CD40 mRNA、ICAM-1蛋白表達水平顯著高于假手術組和對照組(P<0.05)，TRALI組的活化巨噬細胞中TLR4 mRNA、肺組織中CD40 mRNA、ICAM-1蛋白表達水平顯著的低于模型組(P<0.05)；模型組和TRALI組的血清中TNF-ɑ、IL-β、ICAM-1的水平顯著的高于假手術組和對照組(P<0.05)，TRALI組的血清中TNF-ɑ、IL-β、ICAM-1的水平顯著的低于模型組(P<0.05)。結論 TRALI大鼠肺TLR4 mRNA、CD40 mRNA、ICAM-1蛋白高表達，這可能與促進炎癥因子釋放，引起肺損傷有關。

輸血相關急性肺損傷；巨噬細胞；細胞間粘附分子-1

輸血相關性急性肺損傷(transfusion-related acute lung injury，TRALI)主要是指輸入血液或血液制品后6 h內出現的以急性非心源性肺水腫和低氧血癥為主要表現的臨床綜合征，其起病急、發展快，若救治不及時，則會導致患者死亡。[1-2]。TRALI的發病機制尚不完全清楚，多認為與炎癥反應和細胞損傷有關，而巨噬細胞及共刺激分子CD40、血漿及肺組織中細胞間粘附分子-1(ICAM-1)在這一過程中發揮著重要作用[3-4]。為了進一步探討TRALI大鼠肺泡活化巨噬細胞及共刺激分子CD40、血漿及肺組織中細胞間粘附分子-1(ICAM-1)的表達變化及其意義，本研究選取了60只雄性SD大鼠，并隨機分為假手術組(腹腔注射等量生理鹽水)、對照組(腹腔注射2mg/kg脂多糖)、模型組(靜脈輸注脂多糖5mg/kg)和TRALI組(腹腔注射2mg/kg脂多糖+靜脈輸注血漿1mL/只)，檢測了各組大鼠肺組織細胞TLR4 mRNA、 CD40 mRNA、ICAM-1蛋白以及血清中TNF-ɑ、IL-β、ICAM-1的水平，為臨床上提供了一定的理論依據。

資料與方法

一、實驗動物

選取60值SPF級、6-7周齡的雄性SD大鼠，體質量220±10g；購買自上海邦耀生物科技有限公司，動物許可證號：SCXK(滬)2015-0122。

二、實驗儀器與藥品

脂多糖、氯胺酮、PBS均購自美國Sigma公司，Trizol試劑盒、逆轉錄試劑盒以及RT-PCR檢測試劑盒均購自美國Promeg公司, TNF-ɑ、IL-β、ICAM-A檢測試劑盒購自北京中杉金橋生物公司。7900型熒光定量PCR儀為美國應用生物系統公司生產，880型酶標儀為德國拜發儀器公司生產，光學顯微鏡為日本奧林巴斯公司生產。

三、分組與建模

本研究參照Susannah等的建模方法進行建模[5]，具體方法如下：將60只SD大鼠隨機分作假手術組、對照組、模型組和TRALI組，其中TRALI組大鼠經腹腔注射2mg/kg脂多糖，注射2h后腹腔注射80mg/kg氯胺酮進行麻醉，分離大鼠股血管后進行插管，注入含50%肝素的生理鹽水，10 min內移除約1mL血液，然后再輸注等體積的血漿。對照組僅腹腔注射2mg/kg脂多糖，模型組僅靜脈輸注脂多糖5mg/kg，而假手術組僅腹腔注射等量生理鹽水。血漿的制作方法參照Susannah等[5]的方法，即無菌條件下采集大鼠全血，以3000r/min離心10min后進行分離血漿，-80℃條件下進行儲存。

四、標本采集及檢測方法

1 標本采集：造模6h后將大鼠麻醉，摘取眼球后采集外周血約3mL，以3000r/min離心10min后收集上清液備用。將大鼠處死后用PBS灌洗雙肺6次，收BALF約2.5mL/只，以2000 r/min離心10 min，棄去上清液，沉淀細胞備用。剪取大鼠右肺并作兩份，一份以10%的中性甲醛溶液固定，另一份置于液氮中備用。

2 巨噬細胞中TLR4 mRNA的檢測方法：將沉淀細胞以PBS洗滌2次后以1 000 r/min離心10 min，取下層細胞加入含2 mmol/L谷胺酰氨、10%胎牛血清、100 U/L青霉素、100 U/L鏈霉素的RPMI 1640培養液在37℃、5%CO2條件下培養2h，用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養液重懸細胞。利用Trizol試劑盒提取細胞總mRNA，加入逆轉錄試劑盒逆轉為為cDNA，利用RT-PCR試劑盒和熒光定量PCR儀檢測巨噬細胞中TLR4 mRNA表達水平，具體檢測步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。

3 肺組織中CD40 mRNA的檢測方法：采用Trizol試劑盒提取各組肺組織的mRNA，每孔加入約20ug提取mRNA，甲醛凝膠電泳完畢后轉移至尼龍膜上，將膜置于雜交袋中以樣品mRNA與探針在42℃雜交過夜。雜交完畢后壓片，放射顯影并測量條帶的灰度值，以GAPDH作為內參照，兩者灰度的比值即為表達水平。

4 肺組織中ICAM-1蛋白表達的檢測方法：將肺組織作連續切片，采用免疫組化染色試劑盒進行染色，以山羊抗 Ps 多克隆抗體和兔抗 ICAM-1為一抗，以辣根酶標記山羊抗兔 Ig G為二抗，DAB顯色后光鏡下觀察ICAM-1蛋白的表達。

5 血清中炎癥因子的檢測方法：采用酶聯免疫吸附法測定血清中TNF-ɑ、IL-β、ICAM-1水平，具體檢測步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。

五、HE染色

將10%的中性甲醛溶液固定的肺組織作連續切片，厚度約4-6 um，常規石蠟包埋后蘇木精-伊紅(HE)染色封片，光學顯微鏡下觀察肺病理組織學變化。

六、統計學方法

結 果

一、各組大鼠的肺組織HE染色

A為假手術組的肺泡組織結構清晰，肺泡壁薄、結構清楚，肺泡腔內無滲出液及細胞；B為對照組的肺泡壁略有增厚，肺泡結構基本完整，可見部分炎性細胞浸潤；C為模型組可見肺泡組織結構嚴重過受損，破壞嚴重，肺泡腔及肺泡壁組織間充滿炎性細胞，水腫明顯；D為TRALI組，肺泡組織結構損壞程度低于模型組，說明腹腔注射脂多糖、靜脈輸注血漿較單純腹腔注射脂多糖會進一步加重大鼠肺損傷，但較靜脈注射脂多糖的損傷程度輕。(見圖1)。

圖1 A為假手術組、B為對照組、C為模型組、D為TRALI組(HE×400)

二、各組大鼠的活化巨噬細胞中TLR4 mRNA、肺組織中CD40 mRNA表達

模型組組和TRALI組的活化巨噬細胞中TLR4 mRNA、肺組織中CD40 mRNA表達水平顯著的高于假手術組和對照組(P<0.05)，TRALI組的活化巨噬細胞中TLR4 mRNA、肺組織中CD40 mRNA表達水平顯著的低于模型組，P<0.05；(見表1)。

三、各組大鼠肺組織中ICAM-1蛋白表達

模型組組和TRALI組的肺組織中ICAM-1蛋白表達水平顯著的高于假手術組和對照組(P<0.05)，TRALI組的肺組織中ICAM-1蛋白水平顯著的低于模型組，P<0.05；(見表2)。

表1 TLR4 mRNA、CD40 mRNA表達比較相對表達量)

表2 各組大鼠肺組織中ICAM-1蛋白表達值)

四、各組大鼠血清中炎癥因子水平變化

模型組組和TRALI組的血清中TNF-ɑ、IL-β、ICAM-1的水平顯著的高于假手術組和對照組(P<0.05)，TRALI組的血清中TNF-ɑ、IL-β、ICAM-1的水平顯著的低于模型組，P<0.05；(見表3)。

表3 各組大鼠血清中炎癥因子水平變化

討 論

TRALI是一種常見的急性肺損傷類型，也是目前導致患者輸血后死亡的主要原因，其臨床癥狀與急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)相似，且起病急、發展快，患者的病死率非常高[5-6]。目前針對TRALI病理過程最為合理的學說為"二次打擊假說"，主要是指患者輸血前已經存在炎癥反應激活等病理狀態，大量炎性細胞在肺內募集造成一次打擊；而輸血會激活肺內大量募集的炎性細胞，造成肺泡上皮以及毛細血管損傷形成第二次打擊[7-8]。因此，本研究參照“二次打擊假說”將雄性大鼠制作TRALI模型，TRALI組大鼠先腹腔注射脂多糖為第一次打擊，輸注存儲后的血漿為第二次打擊，進而誘導肺損傷；而對照組僅腹腔注射2mg/kg脂多糖，模型組僅靜脈輸注脂多糖5mg/kg，假手術組僅腹腔注射等量生理鹽水。結果表明，TRALI組和模型組大鼠可見肺泡組織結構嚴重過受損，破壞嚴重，肺泡腔及肺泡壁組織間充滿炎性細胞，水腫明顯，提示肺損傷較為明顯，造模成功；而假手術組的肺泡組織結構清晰，肺泡壁薄、結構清楚，肺泡腔內無滲出液及細胞；對照組的肺泡壁略有增厚，肺泡結構基本完整。

一、各組大鼠的活化巨噬細胞中TLR4 mRNA、肺組織中CD40 mRNA表達比較

TRALI的具體發病機制目前尚不完全清楚，多認為與巨噬細胞的激活有關。巨噬細胞廣泛分布在肺泡腔內，具有調節肺部炎癥反應的作用，其在受到打擊后會大量激活，進而促進炎癥反應和氧化應激反應的發生和發展，造成肺泡上皮細胞損傷[9-10]。Toll樣受體4(Toll like receptors 4，TLR4)是巨噬細胞表面重要的模式識別受體，而LPS能夠通過TLR4激活NF-kB，進而促進多種炎癥介質的表達[11]。研究表明[12]，NF-kB能促進共刺激分子CD40的表達，并與其配體CD40L結合，進而增加蛋白酶分子和炎癥介質的表達；而巨噬細胞表面TLR4和CD40過表達是也被認為是TRALI發病的重要因素。本研究通過對各組大鼠活化巨噬細胞中TLR4 mRNA、肺組織中CD40 mRNA表達水平檢測分析發現，模型組和TRALI組的活化巨噬細胞中TLR4 mRNA、肺組織中CD40 mRNA表達水平顯著的高于假手術組和對照組，提示TRALI大鼠的活化巨噬細胞中TLR4 mRNA和肺組織中CD40 mRNA均高表達；而TRALI組的活化巨噬細胞中TLR4 mRNA、肺組織中CD40 mRNA表達水平顯著的低于模型組(P<0.05)，提示脂多糖可上調活化巨噬細胞中TLR4 mRNA和肺組織中CD40 mRNA 的表達，繼而導致TRALI的發生，但靜脈注射脂多糖較腹腔注射脂多糖和靜脈輸注血漿的效果更為明顯。

二、各組大鼠肺組織中ICAM-1蛋白表達比較

ICAM-1是一種蛋白質，主要表達于內皮細胞表面，其也是白細胞CDll/CDl8系統的配體，可介導PMN的活化及血管壁的緊密黏附，進而在炎癥反應的發生和發展過程中發揮著重要作用[13]。研究表明[14-15]，ICAM-1在正常情況下基本不表達或低水平表達，而當其表達升高時可與PMN表面的整合素相互作用，促進PMN黏附于內皮細胞并移至炎性區域，引起過度炎癥反應。本研究通過對各組大鼠肺組織中ICAM-1蛋白表達進行檢測發現，模型組和TRALI組的肺組織中ICAM-1蛋白表達水平顯著高于假手術組和對照組，提示TRALI大鼠肺組織中ICAM-1蛋白高表達；而TRALI組的肺組織中ICAM-1蛋白水平顯著的低于模型組，提示脂多糖可上調大鼠肺組織中ICAM-1蛋白的表達，繼而導致TRALI的發生，但靜脈注射脂多糖較腹腔注射脂多糖和靜脈輸注血漿的效果更為明顯。

三、各組大鼠血清中炎癥因子水平變化

本研究同時發現，模型組組和TRALI組的血清中TNF-ɑ、IL-β、ICAM-1的水平顯著的高于假手術組和對照組(P<0.05)，TRALI組的血清中TNF-ɑ、IL-β、ICAM-1的水平顯著的低于模型組，提示TNF-ɑ、IL-β等炎癥因子的表達與TRALI的發生和發展也有密切的關系，其原因可能是TLR、 CD40以及ICAM-1的表達能激活炎癥反應，進而促進各種炎癥因子的分泌。但本研究限于研究樣本的不足，對于TRALI發病的具體機制仍需作進一步的深入研究。

綜上所述，TRALI大鼠肺TLR4 mRNA、CD40 mRNA、ICAM-1蛋白高表達，這可能與促進炎癥因子釋放，引起肺損傷有關。

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Expression changes of TRALI and CD40 in rat alveolar activated macrophages and co-stimulatory molecules ICAM-1

RAO Qun, ZHU Yu-fang, HUANG Hua.

Department of Clinical Laboratory, Xiangyang Central Hospital, Xiangyang, Hubei 441021, China

Objective To investigate the expression and significance of ICAM-1 in CD40, plasma and lung tissue of rat alveolar activated macrophages and co-stimulatory molecules TRALI. Methods The value of 60 SPF, 6 to 7 week old male SD rats were randomly divided into the sham operation group (intraperitoneal injection of normal saline), the control group (intraperitoneal injection of lipopolysaccharide 2mg/kg), the model group (intravenous infusion of lipopolysaccharide 5mg/kg) and the TRALI group (intraperitoneal injection of 2mg/kg lipopolysaccharide+intravenous infusion of plasma 1ml/only), 15 rats in every group. The expression of TLR4 mRNA in macrophage activation was detected by RT-PCR technology, CD40 mRNA expression by Northern bolt, ICAM-1 protein by immunohistochemical staining, and the serum TNF-ɑ,IL-β and ICAM-1 levels by ELISA. Results The activation of lung tissue macrophages in TLR4 mRNA, CD40 mRNA, ICAM-1 protein expression level was significantly higher in the model group and the TRALI group than in the sham operation group and the control group (P<0.05). The expression levels of CD40 mRNA and ICAM-1 protein in lung tissue and TLR4 mRNA in the TRALI group were significantly lower than those in the model group (P<0.05). The levels of TNF-α, ICAM-1 and IL-β level were significantly higher in the model group and the TRALI group than in the sham group and the control group (P<0.05). The levels of TNF-α, ICAM-1 and IL-β level in serum were significantly lower in the TRALI group than in the model group (P<0.05). Conclusion High expression of TLR4 mRNA, CD40 mRNA and ICAM-1 protein in the lung of TRALI rats may be related with the promotion of the release of inflammatory factors and cause lung injury.

blood transfusion related acute lung injury; macrophages; intercellular adhesion molecule-1

10.3969/j.issn.1009-6663.2017.08.014

1. 441021 湖北 襄陽，襄陽市中心醫院檢驗科 2. 441003 湖北 襄陽，解放軍477醫院醫務科

朱宇芳,E-mail:hanyuchenqiao@126.com

2016-12-14]