廣東漢族人群HBV基因型、基本核心啟動子/前C區突變與肝癌易感相關性研究

劉樹旺 張麗芬 劉利平 劉林森 張悅 李琪 彭公澤 鮑世韻

廣東漢族人群HBV基因型、基本核心啟動子/前C區突變與肝癌易感相關性研究

劉樹旺 張麗芬 劉利平 劉林森 張悅 李琪 彭公澤 鮑世韻

目的 研究廣東漢族肝癌HBV基因型、基本核心啟動子(BCP)/前C區突變與肝癌易感性的相關關系。方法 按照病例對照研究設計方法，納入HBV合并肝癌患者(病例組)100例和HBV攜帶者(對照組)100 例，收集血清樣本，提取HBV DNA，采用巢式PCR擴增HBV S區、BCP及前C區片段，雙向測序，分析HBV基因型、BCP/前C區基因突變與HBV合并肝癌易感性的相關性。結果 病例組BCP區A1762T/G1764A突變及前C區T1858C突變高于對照組，分別為92.0%和73.0%(P<0.05)、52.0%和32.0%(P<0.05)；對照組A1775G突變發生率高于病例組，分別為31.0% 和14.0%(P<0.05)。多因素Logistic 回歸分析顯示，HBV BCP區A1762T/G1764A突變和前C區T1858C 突變與HBV合并肝癌發生獨立相關[OR 6.508(95%CI：1.287～16.739，P<0.05)和3.371(95%CI：2.268～8.163，P<0.05)]；而BCP區A1775G突變則為保護因素[OR=0.163(95%CI：0.043～0.489，P<0.05)]。結論 HBV C基因型是廣東深圳地區HBV合并肝癌的主要流行株，HBV BCP區A1762T、G1764A、A1775G、前C區T1858C基因多態性與HBV合并肝癌的易感性具有密切關系。

肝癌； 乙型肝炎病毒； HBV基因型； 突變

原發性肝癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，高居我國腫瘤死亡率的第3位[1-2]。已經明確的肝癌獨立危險因素有HBV感染、黃曲霉素攝入和飲用水源污染。隨著人們生活水平的改善，食過過期變質食物和飲用污染水源兩大因素已明顯改善，但肝癌發病率仍然處在較高水平。有調查顯示，我國肝癌發病率為26.39/10萬年，且平均每年升高1.0%[3]。人群HBV感染率在短期內仍然難以得到顯著控制，HBV感染仍是目前我國人群肝癌高發的關鍵因素[4]。HBV基因型及基因多態性在HBV合并肝癌易感性中的研究成為熱點。本研究按照病例對照研究設計，探討HBV基因型和基本核心啟動子(BCP)/前C區突變與HBV合并肝癌易感性的相關性。

對象與方法

一、對象

病例組100例，為我院肝膽外科2015年1月～2016年10月收治并確診的HBV合并肝癌患者，對照組100例，為我院體檢科同期健康HBV攜帶者，兩組對象均為廣東深圳地區原著居民(三代以上均生活在本地區)。兩組性別、年齡、丙氨酸氨基轉移酶(ALT)比較差異無統計學意義。病例組中HBV DNA≥105copies/ml者35 例(35.0% )，對照組57例(57.0%)，兩組比較差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

肝癌診斷依據中國抗癌協會肝癌專業委員會發布的《原發性肝癌的臨床診斷與分期標準》[5]。本研究經深圳市人民醫院醫學倫理委員會批準，并取得患者簽署的知情同意書。收集血清標本，分離后置于-80℃冰箱冷藏。

表1 兩組研究對象基本特征比較(例)

二、方法

1.血清HBV DNA水平測定：采用PCR-熒光探針法檢測HBV DNA水平，檢測下限為500 copies/ml。

2.HBV DNA提取和BCP/前C區擴增：取血清200 μl提取HBV DNA，溶于30 μl ddH2O，巢式PCR擴增HBV BCP/前C區和S基因，第一輪擴增引物為Fgp1[ACTCTTGGACTYTCAGCAATG(Y=C or T)] 和Rgp2[GTCAGAAGGCAAAAAAGAGAG]，反應條件：95℃ 2分鐘；95℃ 35秒，56℃ 30秒，72℃ 60秒，共30個循環；72℃ 10分鐘，取1 μl 產物作為模板，二輪擴增引物Fgp3[TCTCAGCAATGTCAACGACCG] 和Rgp4[AGAGAGTAACTCCACAGAWGCTC(W=A or T)]，反應條件同第一輪擴贈。得到279 bp大小的產物。HBV S 區第一輪擴增：引物Fgp5[GGGTCACCATATTCTTGGG] 和Rgp6[GACCCACAATTCTTTGACAT]，反應條件同上；二輪擴增引物Fgp7[GCGGGGTTTTTCTTGTTGA] 和Rgp8[GGGACTCAAGATGTTGTACAG]，反應條件同上。擴增產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，送千年基因科技公司(深圳)進行PCR產物純化，并經ABI 3730xl基因分析儀進行雙向測序。

3.HBV基因型鑒定和突變位點分析：應用Chromas軟件采集測序峰圖。利用NCBI病毒基因分型工具(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Projects/genotyping/formpage.cgi)，比對S區序列，確定HBV基因型。應用DNAMAN對HBV DNA的BCP/前C區進行核苷酸突變分析。

三、統計學處理

結 果

1.HBV基因型：病例組和對照組HBV均為B和C兩種基因型，其中B型占24.0%(48/200，病例組22例，對照組26例)，C型占76.0%(152/200)，提示廣東深圳地區HBV合并肝癌HBV基因型以C型為主。病例組和對照組均以C基因型為主，分別為78.0%(78/100)和74.0%(74/100)。組間HBV基因型的分布比較，差異無統計學意義(P>0.05)。

2.HBV BCP/前C區突變：經測序和分析發現，HBV基因BCP/前C區存在多個突變位點(表2)，其中BCP區A1762T/G1764A和前C區T1858C突變在病例組中的發生率顯著高于對照組，而BCP區A1775G突變在對照組中發生率高于病例組，差異有統計學意義。其余突變位點在兩組病例中分布未見明顯差異。

3.突變位點在不同HBV基因型和不同血清DNA水平上與HBV合并肝癌發生的相關性：在B基因型中，病例組的A1762T/G1764A突變率高于對照組，提示B 基因型A1762T/G1764A 突變可能更易導致HBV合并肝癌的發生。此外，在C基因型中，病例組的T1858C突變率高于對照組，提示C基因型T1858C突變可能與HBV合并肝癌發生相關性更強。HBVDNA≥105copies/ml與HBV DNA<105copies/ml組中，病例組與對照組間突變率比較，差異無統計學意義(表3)。

4.HBV DNA突變位點與HBV合并肝癌相關性的多因素分析：Logistic 回歸進一步篩選HBV合并肝癌易感性的相關因素。納入因素有性別、年齡、基因型分布及A1762T/G1764A和T1858C、A1775G變異。變量賦值：性別(男=0，女=1)、年齡(<50歲=0，≥50歲=1)、基因型(B型=0，C型=1)、HBV DNA復制水平(<105=0，≥105=1)、A1762T/G1764A(未突變=0，突變=1)、A1775G(未突變=0，突變=1)、T1858C(未突變=0，突變=1)。結果顯示，A1762T/G1764A和T1858C、A1775G位點突變均與HBV合并肝癌具有獨立相關性。A1762T/G1764A和T1858C具有增加HBV合并肝癌易感性的趨勢(OR=6.508，95%CI：1.287～16.739，P<0.01；OR=3.371，95%CI：2.268～8.163，P<0.01)。A1775G突變可降低HBV合并肝癌發生風險(OR=0.163，95% CI：0.043～0.489，P<0.01)。HBV B/C基因型分布、HBV DNA血清復制水平則被剔除回歸模型。見表4。

表2 HBV BCP/前C區主要突變位點的單因素分析

表3 HBV基因型和復制水平中各突變位點與HBV合并肝癌發生的關系

表4 A1762T/G1764A和T1858C與HBV合并肝癌關系的多因素回歸分析

討 論

在目前已經鑒定出的10 種HBV基因型(A～J)中，中國人群以B、C型感染為主[6]。本研究發現廣東深圳地區HBV合并肝癌人群所感染HBV基因型僅包括B型和C型，C基因型為主要流行株，且此兩種基因型在HBV合并肝癌人群與HBV攜帶人群中的分布未見差異，提示基因型差異與本地區乙肝相關性肝癌的發病可能無相關性，與鄭丹等[7]研究結果一致。Yang等[8]研究發現，HBVB基因型比例較大，且C基因型的HBV合并肝癌生風險高于B基因型，這種差異可能與研究人群不同有關。本研究顯示，病例組HBV DNA復制水平低于對照組，與文獻報道一致[7]，這可能是由于HBV感染后發展為肝癌的過程，HBV基因整合到肝細胞基因組后，造成病毒復制能力降低，從而導致外周血HBV DNA水平減少[9]。

A1762T/G1764A與HBV合并肝癌發生具有顯著相關性。Guo等[10]對比58 例HBV合并肝癌和71例慢性乙型肝炎患者發現，HBV合并肝癌組BCP區A1762T/G1764A雙聯突變率高于對照組，進一步通過多因素Logistic回歸分析得出，BCP區A1762T/G1764A雙聯突變與HBV合并肝癌發生密切相關。Fang等[11]在廣西人群的研究發現，A1762T/G1764A雙聯突變可能是篩選男性HBV攜帶者合并肝癌發生高危人群的重要生物學標記。鄭丹等[7]選取53例HBV合并肝癌患者及70例HBV攜帶者作為研究對象，證實了在廣西HBV合并肝癌高發人群中，A1762T/G1764A雙聯突變增加肝癌發生風險。本研究結果也顯示，BCP 區A1762T/G1764A雙聯突變在HBV合并肝癌病例組中的突變發生率顯著高于對照組，進一步證實了A1762T/G1764A雙突變與HBV合并肝癌發生具有密切相關性。迄今為止，A1762T/G1764A雙聯突變的確切致癌機制并不明確。有研究表明，BCP 區A1762T/G1764A雙突變可能通過上調pgRNA 轉錄并促進其衣殼化，增加HBcAg的產量，進而促進HBV的復制能力。BCP區A1762T/G1764A雙聯突變可引起其所編碼蛋白質第130位亮氨酸變換為蛋氨酸，而131 位則由纈氨酸變換變為亮氨酸，這使得BCP區原本用于結合內核受體的位點轉變為結合肝細胞核因子-1的位點，使前C區mRNA轉錄效率降低，HBeAg生成水平下降，而pgRNA轉錄水平以及HBcAg合成能力增強[12]。此外，雙聯突變恰處于p53結合區域，這可能影響p53的抑癌效應以及DNA修復功能。

本研究結果顯示，與HBV合并肝癌相關的位點是T1858C突變，而非G1896A，與Sakamoto等[13]和鄭丹等[7]的研究結果一致，提示T1858C突變可能對莖袢結構的穩定起到更為關鍵性的作用。針對香港人群的一項研究表明，在前C區nt1856～nt1858 位點上3個堿基為TCC代表某種特定HBV基因結構，與C基因型其他的結構比較，TCC結構會導致更為病情更為嚴重的肝臟疾病[14]。

本研究顯示，另一個較為罕見的與HBV合并肝癌發生可能相關的突變位點A1775G。與HBV合并肝癌組比較，A1775G突變在慢性HBV攜帶者人群中更為常見。提示此突變可能為肝癌的保護因素，與鄭丹等[7]報道一致，在其他人群中未見報道。對于C 基因型或HBV DNA≥105copies/ml患者中，對照組A1775G突變率高于病例組，目前關于A1775G突變的報道比較少。一項針對兒童乙肝感染病例的研究表明，在發生HBeAg血清學轉化兒童人群中，A1775G突變率相對較高[15]。該位點的突變對HBV合并肝癌易感性的作用和機制還需要進一步探討。

HBV合并肝癌的發生與發展與機體所處的外部環境、基因和所感染的乙肝病毒類型等多種因素相關。單一基因檢測與分析所能提供的信息有限，對多種可能與HBV合并肝癌發生發展相關的基因，包括乙肝病毒基因進行聯合檢測，并分析它們與外界環境之間可能存在的交互作用，從而綜合評價它們與腫瘤易感性的關系具有更高的臨床應用價值。同一種SNP在不同地區人群的頻率構成比分布上存在差異，不同地區和人群的生活習性和對環境致癌因素的暴露水平也存在差異，導致了HBV合并肝癌的發生與發展存在不同的特征。本研究結果支持Yuen等[16]的觀點，他們的研究也認為，BCP變異是HBV合并肝癌的最重要高危因素，C基因型本身與HBV合并肝癌發生不存在直接相關性，可能是由于更易導致BCP變異而增加HBV合并肝癌的易感風險。此外，針對臺灣人群的研究表明，只要發生了BCP變異，無論是B或C基因型，均具有較高的HBV合并肝癌發生風險，且兩種基因型間沒有顯著差異[17]。

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(本文編輯：楊澤平)

Hepatitis B virus genotype and BCP/Pre-C region gene polymorphisms in susceptibility to hepatocellular carcinoma among the Chinese Han population in Shenzhen，Guangdong

LIUShuwang，ZHANGLifen，LIULiping，etal.

(DepartmentofHepatobiliaryandPancreaticSurgery，ShenzhenPeople＇sHospital，SecondClinicalMedicalCollegeofJinanUniversity，Shenzhen518020，China)

Objective To investigate the relationship between hepatitis B virus (HBV)genotype，polymorphisms in basic core promoter(BCP)region/pre-core(Pre-C)region and the incidence of hepatocellular carcinoma(HCC)in Guangdong Province.Methods In this case-control study，100 HCC patients and 100 asymptomatic HBV carriers were included.Blood samples were collected from them for serum separation and HBV DNA extraction.The DNA sequences of the S region and BCP/Pre-C region of HBV was determined by direct sequencing following nested-PCR amplification.The relationship between the genotype，gene mutation of HBV and the incidence of HCC was analyzed.Results The mutation rates of the A1762T/G1764A in the BCP region and the T1858C in the Pre-C region of HBV were significantly higher in HCC group than in control group(92% vs.73%，P<0.05；52% vs.32%，P<0.05).The mutation rate of A1775G was significantly higher in control group (31%) than in HCC group (14%)(P<0.05).Binary logistic regression analysis indicated that A1762T/G1764A and T1858C mutations are the risk factors for the development of HCC(OR 6.508，95%CI：1.287～16.739，P<0.05 and 3.371，95%CI：2.268～8.163，P<0.05).A1775G is a protective factor in the development of HCC(OR=0.163，95%CI：0.043～0.489，P<0.05).Conclusion BCP A1762T/G1764A，A1775G and Pre-C T1858C mutations are correlated with the incidence of HCC in Guangdong.

hepatocellular carcinoma； hepatitis B virus； genotype of HBV； mutation

10.3969/j.issn.1005-6483.2017.06.014

深圳市科技創新資助項目(JCYJ20160422152408705、JCYJ20150403101028198)

518020 暨南大學第二臨床醫學院(深圳市人民醫院)肝膽胰外科

鮑世韻，Email：baomi94@163.com

2017-02-21)