膠質(zhì)瘤中間質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1及神經(jīng)生長(zhǎng)因子的表達(dá)及臨床意義

張旭標(biāo) 林濤 曾永親 鄭定容

膠質(zhì)瘤中間質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1及神經(jīng)生長(zhǎng)因子的表達(dá)及臨床意義

張旭標(biāo) 林濤 曾永親 鄭定容

目的 探討間質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1(SDF-1)及神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及臨床意義。方法 收集手術(shù)切除的人腦膠質(zhì)瘤病理標(biāo)本86例為觀察組，其中觀察組按不同病理級(jí)別分為Ⅰ級(jí)15例為Ⅰ組，Ⅱ級(jí)24例為Ⅱ組，Ⅲ級(jí)26例為Ⅲ組，Ⅳ級(jí)21例為Ⅳ組，同期隨機(jī)選擇顱腦外傷患者正常腦組織標(biāo)本84例為對(duì)照組，2組組織均使用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)技術(shù)檢測(cè)SDF-1與NGF mRNA，同時(shí)采用免疫組化法檢測(cè)2組組織中SDF-1與NGF蛋白的表達(dá)情況。比較2組組織中SDF-1與NGF mRNA及蛋白表達(dá)情況。結(jié)果 觀察組SDF-1與NGF mRNA基因表達(dá)量及蛋白陽(yáng)性率均高于對(duì)照組(P<0.05)；Ⅳ組SDF-1與NGF mRNA基因表達(dá)量及蛋白陽(yáng)性率均高于Ⅲ組；Ⅲ組SDF-1與NGF mRNA基因表達(dá)量及蛋白陽(yáng)性率均高于Ⅱ組；Ⅱ組SDF-1與NGF mRNA基因表達(dá)量及蛋白陽(yáng)性率均高于Ⅰ組，膠質(zhì)瘤組織中SDF-1與NGF mRNA基因表達(dá)量及蛋白陽(yáng)性率隨病理級(jí)別的增高而增高(P<0.05)；膠質(zhì)瘤組織中SDF-1 mRNA表達(dá)量及蛋白陽(yáng)性率呈正相關(guān)(r=0.95，P<0.05)，NGF mRNA表達(dá)量及蛋白陽(yáng)性率呈正相關(guān)(r=0.96，P<0.05)；SDF-1和NGF高表達(dá)均是預(yù)測(cè)膠質(zhì)瘤預(yù)后不良的獨(dú)立因素(P<0.01)，SDF-1和NGF的高表達(dá)與膠質(zhì)瘤患者整體不良預(yù)后顯著相關(guān)。結(jié)論 膠質(zhì)瘤中SDF-1與NGF高表達(dá)對(duì)病變進(jìn)展有一定促進(jìn)作用，二者與腫瘤的病理級(jí)別密切相關(guān)，兩者相互作用，SDF-1與NGF在膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展中扮演重要的角色，有望為膠質(zhì)瘤的臨床檢測(cè)及治療提供新思路。

膠質(zhì)瘤；間質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1；神經(jīng)生長(zhǎng)因子；實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)；免疫組化

膠質(zhì)瘤是最常見(jiàn)的顱內(nèi)原發(fā)性惡性腫瘤之一，膠質(zhì)瘤的生長(zhǎng)方式為浸潤(rùn)性生長(zhǎng)，藥物治療與手術(shù)治療圴預(yù)后差，發(fā)率非常高，其致殘率及致死率均很高[1]。膠質(zhì)瘤發(fā)病原因尚不明確，其病變進(jìn)展中出現(xiàn)多種蛋白表達(dá)失調(diào)[2]；間質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1(SDF-1)及神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)基因及蛋白表達(dá)是近年來(lái)腫瘤學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一，有研究認(rèn)為SDF-1與NGF與多種惡性腫瘤的預(yù)后特別是腫瘤的轉(zhuǎn)移有關(guān)[3]，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)定量與免疫組化定性技術(shù)，探討SDF-1與NGF基因及其蛋白表達(dá)水平與膠質(zhì)瘤的惡性程度的關(guān)系及臨床診斷價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2012年1月至2015年1月廣東三九腦科醫(yī)院神經(jīng)外科手術(shù)切除的人腦膠質(zhì)瘤病理標(biāo)本86例為觀察組，男43例，女43例；年齡13～75歲，平均年齡(45.6±12.2)歲；患者術(shù)前未接受放化療等治療，均無(wú)其他腫瘤病史，均排除肝、腎、肺、心臟和血液性疾病，患者均有齊全完整的臨床資料，所有病理標(biāo)本均取出一部分成制作成石蠟切片，通過(guò)HE染色后，由病理科組織兩名經(jīng)驗(yàn)豐富病理醫(yī)生進(jìn)行雙盲鏡檢讀片，按2007版WHO制定的中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分類標(biāo)準(zhǔn)[4]，對(duì)標(biāo)本進(jìn)行組織學(xué)及病理學(xué)分級(jí)，其中Ⅰ級(jí)15例為Ⅰ組，Ⅱ級(jí)24例為Ⅱ組，Ⅲ級(jí)26例為Ⅲ組，Ⅳ級(jí)21例為Ⅳ組，同期隨機(jī)選擇顱腦外傷后行顱內(nèi)減壓患者的手術(shù)中切取正常腦組織標(biāo)本84例為對(duì)照組，男42例，女42例；年齡12～76歲，平均年齡(46.2±11.9)歲。2組年齡和性別比差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2 方法 觀察組患者組織標(biāo)本為外科手術(shù)切取的腦膠質(zhì)瘤標(biāo)本，對(duì)照組患者組織標(biāo)本為顱腦外傷手術(shù)切除的正常腦組織標(biāo)本。2組均在術(shù)中各取2份標(biāo)本，其中一份標(biāo)本通過(guò)甲醛固處理備用，另外一份標(biāo)本通過(guò)液氮固定處理備用。

1.2.1 免疫組化法檢測(cè):SDF-1和NGF表達(dá)檢測(cè)：SDF-1和NGF表達(dá)的檢測(cè)采用采用免疫組化SP法，步驟均嚴(yán)格按照試劑盒的說(shuō)明書進(jìn)行操作。結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)判定：所有的免疫組化SP切片均由兩位病理學(xué)主治醫(yī)師以上的醫(yī)師對(duì)的染色結(jié)果進(jìn)行評(píng)定，在高倍鏡下(400倍) 隨機(jī)抽取5個(gè)視野，判斷標(biāo)準(zhǔn)參照隋銳等[5]的計(jì)數(shù)方法計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞率，陰性：比率<5%；弱陽(yáng)性：比率5%～25%；陽(yáng)性：比率26%～50%；強(qiáng)陽(yáng)性>51%。總陽(yáng)性率：弱陽(yáng)性率+陽(yáng)性率+強(qiáng)陽(yáng)性率。見(jiàn)圖1。

圖1 免疫組化SDF-1和NGF 蛋白在膠質(zhì)瘤組織中表達(dá)情況(×400)

A:正常對(duì)照腦組織；B: 免疫組化SDF-1和NGF 蛋白低度表達(dá)；C: 免疫組化SDF-1和NGF 蛋白中度表達(dá)；D: 免疫組化SDF-1和NGF 蛋白高度表達(dá)

1.2.2 RT-PCR定量檢測(cè):PCR引物序列：參照Tsuyoshi等[6]方法設(shè)計(jì)正反及探針義鏈，內(nèi)參基因?yàn)楦视腿?3-磷酸脫氫酶(GAPDH)均由FAM標(biāo)記，由廣州中山大學(xué)達(dá)安基因有限公司合成，與設(shè)計(jì)的目的片段大小一致。各組份的檢測(cè)所需的標(biāo)本均采用液氮固定處理的標(biāo)本，并按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行SDF-1與NGF的RNA萃取，RT-PCR方法獲得cDNA片段，基因分析采用美國(guó)MJR Option(2) 實(shí)時(shí)熒光FQ-PCR分儀自帶的基因分析應(yīng)用軟件及Gen Bank對(duì)比分析基因序列同源性，RNA表達(dá)量與內(nèi)參基因的比值表示 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。見(jiàn)表1。

表1 引物與探針序列

2 結(jié)果

2.1 2組患者SDF-1與NGF mRNA基因表達(dá)量及蛋白陽(yáng)性率比較 觀察組SDF-1與NGF mRNA基因表達(dá)量及蛋白陽(yáng)性率均高于對(duì)照組(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 2組患者組織SDF-1與NGF mRNA基因表達(dá)量及蛋白陽(yáng)性率比較

2.2 膠質(zhì)瘤各組mRNA基因表達(dá)量及蛋白陽(yáng)性率比較 Ⅳ組SDF-1與NGF mRNA基因表達(dá)量及蛋白陽(yáng)性率均高于Ⅲ組；Ⅲ組SDF-1與NGF mRNA基因表達(dá)量及蛋白陽(yáng)性率均高于Ⅱ組；Ⅱ組SDF-1與NGF mRNA基因表達(dá)量及蛋白陽(yáng)性率均高于Ⅰ組，膠質(zhì)瘤組織中SDF-1與NGF mRNA基因表達(dá)量及蛋白陽(yáng)性率隨病理級(jí)別的增高而增高(P<0.05)；SDF-1 mRNA表達(dá)量與NGF mRNA表達(dá)量呈正相關(guān)(r=0.86，P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 SDF-1與NGF mRNA基因表達(dá)量及蛋白陽(yáng)性率在TNM分期表達(dá)比較

2.3 SDF-1和NGF預(yù)后相關(guān)性分析 SDF-1和NGF高表達(dá)均是預(yù)測(cè)膠質(zhì)瘤預(yù)后不良的獨(dú)立因素(P<0.01)，SDF-1和NGF的高表達(dá)與膠質(zhì)瘤患者整體不良預(yù)后顯著相關(guān)。見(jiàn)表4、5。

WHO分級(jí)SDF?1高表達(dá)例生存期(月)SDF?1低表達(dá)例生存期(月)NGF高表達(dá)例生存期(月)NGF低表達(dá)例生存期(月)Ⅰ～Ⅱ1828．8±6．71139．4±7．91727．6±8．61240．6±8．5Ⅲ～Ⅳ2011．6±4．42718．8±6．82210．5±3．72520．5±7．3t值35．641．331．345．2P值<0．01<0．01<0．01<0．01

表5 SDF-1和NGF mRNA表達(dá)量風(fēng)險(xiǎn)級(jí)別分析

3 討論

神經(jīng)膠質(zhì)瘤是一種起源于膠質(zhì)細(xì)胞的最常見(jiàn)的顱內(nèi)原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤，約占顱內(nèi)腫瘤50%，發(fā)病率居腦原發(fā)性惡性腫瘤首位[7]，呈浸潤(rùn)性生長(zhǎng)，常侵犯大腦的重要解剖和功能區(qū)域，難以治愈。目前，對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤診斷及病情變化的判斷主要依靠主要依賴影像學(xué)檢查及術(shù)后病理診斷，但依然存在一定局限性，缺乏具有指導(dǎo)意義的腫瘤標(biāo)記物，盡管近年來(lái)報(bào)到了許多與神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤相關(guān)的蛋白及因子，但關(guān)于這些蛋白對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤診斷及預(yù)后的提示作用至今尚未達(dá)成共識(shí)[8]。

SDF-1是來(lái)源于骨髓基質(zhì)細(xì)胞及其他相關(guān)的上皮細(xì)胞和間皮細(xì)胞所分泌的具有特殊化學(xué)誘導(dǎo)作用的生物因子，其產(chǎn)生與炎性反應(yīng)無(wú)直接相關(guān)，是趨化因子 家族成員之一，參與腫瘤細(xì)胞趨化性、血管生成及腫瘤轉(zhuǎn)移的功能，有研究表明，SDF-1在多種腫瘤中均有表達(dá)，參與了腫瘤細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移[9]。NGF存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的海馬、腦干和大腦皮質(zhì)中的神經(jīng)元及膠質(zhì)細(xì)胞之中，受體酪氨酸激酶 (Trk)家族和NGF家族呈高度特異性親和合，特別是 TrkA和NGF高度相結(jié)合[10]，NGF是神經(jīng)系統(tǒng)重要的營(yíng)養(yǎng)因子，是多功能性生長(zhǎng)因子，對(duì)神經(jīng)元與前體細(xì)胞發(fā)揮著促進(jìn)生長(zhǎng)、分化、再生與修復(fù)等重要作用[11]。本研究通過(guò)觀察SDF-1和NGF在膠質(zhì)瘤的惡性程度的關(guān)系，為膠質(zhì)瘤的臨床檢測(cè)及治療提供理論依據(jù)和新思路。

本研究結(jié)果表明，SDF-1和NGF在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)明顯高于正常腦組織中的表達(dá)，這提示膠質(zhì)瘤在生長(zhǎng)過(guò)程中，由于膠質(zhì)瘤細(xì)胞的自我分泌作用，進(jìn)入腦組織中，膠質(zhì)瘤本身刺激其周圍的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞分泌SDF-1和NGF所致；胚胎發(fā) 育時(shí)期，腦組織中NGF mRNA表達(dá)量與膽堿能神經(jīng)元中乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶的活性呈正相關(guān)，成年后消失，腦組織中神經(jīng)損傷后NGF又重新大量表達(dá)[11]。腫瘤的發(fā)生是一個(gè)多因素參與、多基因突變、多步驟、多階段進(jìn)展的復(fù)雜事件，本研究發(fā)現(xiàn)NGF與SDF-1的表達(dá)從正常組到膠質(zhì)瘤Ⅰ級(jí)、Ⅱ級(jí)、Ⅲ級(jí)組逐漸增高，且差異均有顯著性； SDF-1是表達(dá)于腦組織中的趨化因子之一，在正常的腦組織中，維持較低的生物水平，不發(fā)揮遷移及趨化的作用，主要是由星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元表達(dá)，當(dāng)腦組織發(fā)生低氧、缺血和炎癥等病變后，SDF-1高度表達(dá)，趨化免疫系統(tǒng)的單核細(xì)胞—巨噬細(xì)胞向受損腦組織遷移并發(fā)揮相應(yīng)的免疫生物學(xué)效應(yīng)，SDF-1能夠激活機(jī)體的ERK-1/2和Akt信號(hào)通路，調(diào)節(jié)抗凋亡信號(hào)途徑促進(jìn)細(xì)胞增殖。NGF是神經(jīng)系統(tǒng)重要的營(yíng)養(yǎng)因子之一，NGF是促進(jìn)神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的必須因子，具有多功能性生長(zhǎng)因子，其表達(dá)主要在神經(jīng)系統(tǒng)，不僅可促進(jìn)神經(jīng)的生長(zhǎng)和分化，而且對(duì)免疫和炎癥細(xì)胞具有確切的趨化和增殖活性，王向鵬等[12]研究表明，NGF在膠質(zhì)瘤的發(fā)生和增殖過(guò)程中，除了膠質(zhì)腫瘤細(xì)胞自身分泌還激活海馬和皮質(zhì)等部位合成和釋放NGF。膠質(zhì)腫瘤腦組織中NGF與SDF-1表達(dá)水平相關(guān)性分析結(jié)果表明，腦組織中SDF-1 mRNA表達(dá)量與NGF mRNA表達(dá)量呈正相關(guān)，SDF-1和NGF的表達(dá)與膠質(zhì)瘤患者整體不良預(yù)后密切相關(guān)，NGF與SDF-1間的相互作用是影響膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的重要因素，提示NGF與SDF-1相互協(xié)調(diào)促進(jìn)神經(jīng)膠質(zhì)瘤的發(fā)生，共同參與了神經(jīng)膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移及浸潤(rùn)，膠質(zhì)瘤細(xì)胞是一個(gè)復(fù)雜的細(xì)胞學(xué)和生物化學(xué)對(duì)損傷與再生的反應(yīng)性調(diào)控過(guò)程，當(dāng)損傷刺激后NGF與SDF-1即逆轉(zhuǎn)為高表達(dá)狀態(tài)。本試驗(yàn)的結(jié)果可以看出NGF與SDF-1在腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)風(fēng)險(xiǎn)級(jí)別回歸分析，NGF與SDF-1的表達(dá)水平與患者的年齡、性別和腫瘤的大小無(wú)明顯關(guān)系，而與膠質(zhì)腫瘤的分化程度有密切關(guān)系，提示NGF與SDF-1的高表達(dá)是膠質(zhì)腫瘤發(fā)生的重要的危險(xiǎn)因素之一，NGF與SDF-1共同協(xié)同作用，在促進(jìn)膠質(zhì)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移及浸潤(rùn)中可發(fā)揮重要作用。

綜上所述 ，膠質(zhì)瘤中SDF-1與NGF高表達(dá)對(duì)病變進(jìn)展有一定促進(jìn)作用，二者與腫瘤的病理級(jí)別密切相關(guān)，兩者相互作用，SDF-1與NGF在膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展中扮演重要的角色，有望為膠質(zhì)瘤的臨床檢測(cè)及治療提供新思路。

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Expression and clinical significance of stromal cell-derived factor-1 and nerve growth factor in gliomas

ZHANGXubiao,LINTao,ZENGYongqin,etal.

DepartmentofNeurosurgery,Guangdong999BrainHospital,Guangzhou510510,China

Objective To investigate the expression and clinical significance of stromal cell-derived factor-1 (SDF-1) and nerve growth factor (NGF) in gliomas.Methods Eighty-six pathological specimens of human brain glioma that were collected in our hospital from January 2012 to February 2016 were enrolled as observation group,moreover,which was redivided into 4 subgroups according to different pathological grade,including 15 cases in grade Ⅰ group,24 cases in grade Ⅱ group,26 cases in grade Ⅲ group,21 cases in grade Ⅳ group,moreover,the other 84 cases of brain tissue specimens of patients with craniocerebral trauma were seclected as control group. The expression levels of SDF-1 and NGF mRNA were detected by Real-time quantitative polymerase chain reaction (RT-PCR), at the same time,the expression levels of SDF-1 and NGF protein were detected by immunohistochemistry.Results The expression levels of SDF-1 and NGF mRNA gene and protein in observation group were significantly higher than those in control group (P<0.05).The expression levels of SDF-1 gene,NGF mRNA and protein in grade Ⅳ group were significantly higher than those in grade Ⅲ group,which in grade Ⅲ group were significantly higher than those in grade Ⅱ group, moreover, which in grade Ⅱ group were significantly higher than those in grade Ⅰ group, besides,the expression levels of SDF-1, NGF mRNA gene and protein in glioma were increased with the increase of pathological grade (P<0.05). Moreover the expression levels of SDF-1 mRNA in gliomas were positively correlated to positive rates of protein (r=0.95,P<0.05),and the expression levels of NGF mRNA were positively correlated to positive rates of protein (r=0.96,P<0.05).Moreover the high expression of SDF-1 NGF was independent factors to predict poor prognosis of glioma (P<0.01),and the high expression of SDF-1 NGF was closely correlated to whole poor prognosis of patients with glioma.Conclusion The high expression of SDF-1 and NGF in gliomas has a certain role in promoting progression of disease,both of them are closely correlated with pathological grade,thus,both factors play an important role in pathogenesis and development of glioma,it is expected to provide new ideas for clinical detection and treatment of glioma.

glioma; stromal cell-derived factor-1; nerve growth factor; real-time quantitative polymerase chain reaction; immunohistochemistry

10.3969/j.issn.1002-7386.2017.15.002

510510 廣州市，廣東三九腦科醫(yī)院神經(jīng)外科(張旭標(biāo)、林濤、曾永親);廣東省深圳市寶安區(qū)中心醫(yī)院社區(qū)健康服務(wù)管理中心(鄭定容)

R 338.15

A

1002-7386(2017)15-2250-04

2016-11-12)