穿心蓮內(nèi)酯通過核因子-κB通路對口腔鱗癌細(xì)胞的抑制及其作用機(jī)制

申 俊 王 炫 高 峰 孟文霞

(廣東省口腔醫(yī)院牙周黏膜科，廣東 廣州 510280)

穿心蓮內(nèi)酯通過核因子-κB通路對口腔鱗癌細(xì)胞的抑制及其作用機(jī)制

申 俊 王 炫 高 峰 孟文霞

(廣東省口腔醫(yī)院牙周黏膜科，廣東 廣州 510280)

目的 探究穿心蓮內(nèi)酯對人口腔鱗癌(OSCC)細(xì)胞抑制作用及其機(jī)制。方法 MTT實(shí)驗檢測穿心蓮內(nèi)酯對SAS人OSCC細(xì)胞系增殖的作用；Western印跡檢測穿心蓮內(nèi)酯對SAS人OSCC細(xì)胞系中p65、p65(Ser536)和cyclin D1表達(dá)的影響；細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗檢測穿心蓮內(nèi)酯對SAS人OSCC細(xì)胞系中p65(Ser536)和cyclin D1表達(dá)的影響。結(jié)果 MTT實(shí)驗表明穿心蓮內(nèi)酯可抑制SAS人OSCC細(xì)胞系增殖并且其抑制作用呈劑量、時間依賴性(P<0.05)；Western印跡以及細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗結(jié)果顯示穿心蓮內(nèi)酯可降低p65磷酸化以及cyclin D1表達(dá)(P<0.05)。結(jié)論 穿心蓮內(nèi)酯可以通過抑制p65磷酸化減少cyclin D1表達(dá)，從而降低核因子(NF)-κB活性抑制SAS人OSCC細(xì)胞系增殖。穿心蓮內(nèi)酯可以作為治療OSCC的潛在新型藥物。

穿心蓮內(nèi)酯；NF-κB信號通路；SAS人口腔鱗癌細(xì)胞系

口腔鱗狀細(xì)胞癌(OSCC)是頭頸部最常見的癌癥，容易發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移，從而對患者的生活質(zhì)量和生命產(chǎn)生極大的危害〔1〕。穿心蓮是傳統(tǒng)中藥材，在亞洲各國中廣泛用于緩解喉嚨痛、腹瀉和其他炎癥癥狀〔2〕。穿心蓮內(nèi)酯屬于二萜內(nèi)酯類化合物，從穿心蓮中分離，是其主要的生物活性成分〔3，4〕。最近，國內(nèi)外有多篇文獻(xiàn)報道穿心蓮內(nèi)酯及其衍生物在抗感染、抗腫瘤方面具有顯著作用，包括穿心蓮內(nèi)酯抑制肝癌細(xì)胞和前列腺癌細(xì)胞增殖〔5，6〕。穿心蓮內(nèi)酯可以通過死亡受體介導(dǎo)通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡〔7〕，通過抑制ERK1/2通路，誘導(dǎo)腫瘤壞死細(xì)胞(TNF)-α合成并且刺激毒性T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生從而抑制體內(nèi)腫瘤生長〔8〕。穿心蓮內(nèi)酯還可以抑制腫瘤引起的血管生成，通過降低血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、一氧化氮(NO)和多種炎癥細(xì)胞因子和化學(xué)因子的表達(dá)，增加抗血管生成因子表達(dá)〔9〕。然而穿心蓮內(nèi)酯抑制腫瘤的具體作用機(jī)制還不清楚。核因子(NF)-κB是一種重要的腫瘤調(diào)控因子，NF-κB家族包括p105/p50 (NF-κB1)、p100/p52 (NF-κB2)、p65 (RelA)、RelB，和c-Rel，其中p50/p65異質(zhì)二聚體分布最為廣泛〔10〕。p50/p65異質(zhì)二聚體位于細(xì)胞質(zhì)并在細(xì)胞質(zhì)與IκB抑制蛋白結(jié)合。一旦激活，IκB蛋白可迅速被IκB激酶α和β(IKKα和IKKβ)快速磷酸化，然后被泛素-蛋白酶體通路降解〔11〕，p50/p65異質(zhì)二聚體遷移到核轉(zhuǎn)錄，上調(diào)下游基因從而調(diào)控先天免疫、炎癥、細(xì)胞生長及凋亡〔12〕。因此，NF-κB的激活需要IKKα和β磷酸化p65使p65從IKK復(fù)合物中釋放〔13〕。NF-κB的持續(xù)活化可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖，抑制腫瘤細(xì)胞凋亡，促進(jìn)血管的新生以及促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。 既往有研究提示，NF-κB通路可能是穿心蓮內(nèi)酯的主要作用靶點(diǎn)〔14〕，但其具體的作用機(jī)制仍不明了。本研究擬觀察穿心蓮內(nèi)酯對OSCC SAS細(xì)胞生長增殖及其對NF-κB信號通路蛋白的影響。

1 資料與方法

1.1 主要試劑 高糖DMEM培養(yǎng)基，胎牛血清(FBS)，青-鏈霉素購自美國Invitrogen，穿心蓮內(nèi)酯購自美國Sigma-Aldrich公司，p65、p65(Ser536)和cyclin D1購自Santa Cruz Biotechnology公司。

1.2 細(xì)胞來源及培養(yǎng) SAS人OSCC細(xì)胞系購自ATCC(American Type Culture Collection，Manassas，VA，USA)，SAS細(xì)胞在高糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)，同時在培養(yǎng)基中加入10%FBS和1%青霉素-鏈霉素，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 方法

1.3.1 MTT實(shí)驗 SAS細(xì)胞系接種于96孔板，每孔接種細(xì)胞數(shù)為0.5×104個。接種24 h之后分兩組處理，每組設(shè)置5個復(fù)孔。一組用不同濃度的穿心蓮內(nèi)酯處理SAS細(xì)胞48 h，濃度分別為0、25、50、100 μmol/L(穿心蓮內(nèi)酯溶解于DMSO)；另外一組用50 μmol/L穿心蓮內(nèi)酯處理細(xì)胞24、48、72 h。之后兩組加入20 μl MTT工作液，培養(yǎng)4 h。棄掉培養(yǎng)基，每孔加200 μl DMSO，震蕩溶解結(jié)晶物，在酶聯(lián)免疫檢測儀490 nm處檢測吸光值。

1.3.2 Western印跡實(shí)驗 用不同濃度穿心蓮內(nèi)酯(0、25、50和100 μmol/L)處理SAS細(xì)胞系48 h后，棄掉培養(yǎng)基，PBS洗滌細(xì)胞，然后加細(xì)胞裂解液RIPA(蛋白酶抑制劑：RIPA=1∶1 000)，冰上裂解30 min，刮蛋白。4℃，13 000 r/min，離心13 min后吸上清液轉(zhuǎn)移到另外一支EP管，用BCA工作液檢測蛋白含量。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，分離后電轉(zhuǎn)到PVDF上，5%牛奶封閉1 h。用TBST洗膜3次，5 min/次。孵育p65抗體、p65(Ser536)抗體、cyclin D1抗體和GAPDH抗體過夜。TBST洗膜3次，5 min/次。孵育相應(yīng)的辣根過氧化物酶連接的二抗，TBST洗膜3次，10 min/次。 撒發(fā)光液，用自動顯影儀顯影并分析條帶灰度。

1.3.3 細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗 SAS細(xì)胞系接種于6孔板中，每孔密度為4×105個。實(shí)驗組細(xì)胞與100 μmol/L穿心蓮內(nèi)酯孵育48 h，對照組細(xì)胞與DMSO溶液孵育48 h。兩組細(xì)胞用多聚甲醛溶液固定20 min，之后與0.5% Triton X-100孵育10 min。PBS洗滌，3次，5 min/次。將固定的細(xì)胞與4%的BSA溶液在室溫封閉2 h，之后用適當(dāng)比例的p65(Ser536)和cyclin D1抗體4℃孵育過夜。PBS洗滌3次，5 min/次。不同二抗37℃孵育1 h(山羊抗兔的FITC標(biāo)記的二抗和山羊抗小鼠的Cy3標(biāo)記的二抗)，在熒光顯微鏡下觀察。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS17.0軟件行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 穿心蓮內(nèi)酯對SAS細(xì)胞系的細(xì)胞毒性作用 MTT實(shí)驗表明穿心蓮內(nèi)酯可以顯著抑制SAS細(xì)胞系增殖，并且具有濃度、時間依賴的關(guān)系(P<0.05)。

2.2 Western印跡 p65(Ser536)磷酸化可以表明NF-κB活性，cyclin D1是NF-κB下游調(diào)節(jié)基因〔14〕。隨著穿心蓮內(nèi)酯濃度增加，p65含量沒有變化，但磷酸化p65(Ser536)含量以及cyclin D1含量減少(P<0.05)。見圖1。

A：不同濃度穿心蓮內(nèi)酯(0、25、50、100 μmol/L)作用于p65、p65(Ser536)、cyclin D1；B：將相關(guān)蛋白表達(dá)情況與內(nèi)參GAPDH比值量化成直方圖，其中AG是穿心蓮內(nèi)酯，分別為濃度0、25、50、100 μmol/L；1)P<0.05，2)P<0.01圖1 Western印跡檢測結(jié)果

2.3 免疫熒光實(shí)驗 免疫熒光實(shí)驗結(jié)果表明穿心蓮內(nèi)酯(100 μmol/L)可以抑制p65(Ser536)(綠色)與cyclin D1(紅色)的表達(dá)。見圖2。

圖2 用100 μmol/L穿心蓮內(nèi)酯處理SAS細(xì)胞系48 h之后p65(Ser536)(綠色)和cyclin D1(紅色)免疫染色情況

3 討 論

穿心蓮有多種藥理作用，例如抗腫瘤、抗HIV、抗病毒感染以及血管保護(hù)功能〔1〕。穿心蓮主要活性成分為二萜內(nèi)酯、黃酮、多酚等物質(zhì)，其中最主要的成分為穿心蓮內(nèi)酯，其被認(rèn)為是最重要的治療成分〔16〕。

據(jù)報道，NF-κB活性與腫瘤形成和遷移密切相關(guān)〔17〕。NF-κB異常激活可以調(diào)節(jié)多種腫瘤的病理反應(yīng)，包括細(xì)胞周期過程、增殖以及凋亡。Western印跡實(shí)驗表明穿心蓮內(nèi)酯可以顯著抑制p65(Ser536)與cyclin D1，同時免疫熒光實(shí)驗顯示穿心蓮內(nèi)酯同樣可以抑制p65(Ser536)與cyclin D1，通過NF-κB家族成員p65磷酸化減少以及下游基因cyclin D1減少說明NF-κB的活性降低。

總之，本研究說明穿心蓮內(nèi)酯通過NF-κB通路對SAS人口腔鱗癌細(xì)胞系發(fā)揮重要作用，穿心蓮內(nèi)酯通過減弱p65磷酸化以及cyclin D1表達(dá)降低NF-κB活性，進(jìn)而抑制SAS細(xì)胞增殖。

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〔2017-01-03修回〕

(編輯 郭 菁)

廣東省醫(yī)學(xué)科研基金項目(2016159618)

申 俊(1979-)，女，副主任醫(yī)師，博士，主要從事口腔黏膜病病因及防治研究。

R73

A

1005-9202(2017)13-3181-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.13.025