銀杏葉提取物對大鼠心肌缺血再灌注損傷的作用及其機制

鄢曉平 黃 煜 彭亞飛 陳良龍 吳黎明

(福建醫科大學附屬協和醫院心內科，福建 福州 350001)

銀杏葉提取物對大鼠心肌缺血再灌注損傷的作用及其機制

鄢曉平 黃 煜 彭亞飛 陳良龍 吳黎明

(福建醫科大學附屬協和醫院心內科，福建 福州 350001)

目的 探討銀杏葉提取物對大鼠心肌缺血再灌注損傷(MIRI)的作用及其可能的抗氧化機制。方法 30只Wistar 雄性大鼠隨機分為假手術組(Sham組)、缺血再灌注組(I/R組)、銀杏葉藥物組(GBE組)，每組10只，銀杏葉灌胃1 w后制備心肌缺血模型。蘇木素-伊紅(HE)染色觀察各組大鼠形態學改變；心肌梗死面積利用TTC染色測定；根據試劑盒說明測定血清超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)及谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)含量。結果 Sham組可見心肌細胞排列整齊，各結構完整，細胞核均勻分布；模型組部分心肌細胞壞死，細胞之間界限欠清，細胞水腫，排列紊亂；GBE組細胞小部分結構模糊，細胞界限尚清晰，輕度水腫。GBE組大鼠心肌梗死面積明顯低于I/R組。同時，I/R組SOD活力及GSH-Px含量顯著低于Sham組，MDA水平高于I/R組(均P<0.05)，GBE組血清SOD、GSH-Px含量明顯高于I/R組，MDA水平低于I/R組(P<0.05)。結論 GBE對大鼠MIRI具有明顯的保護作用，其可能與抑制氧化應激作用有關。

銀杏葉提取物；心肌缺血再灌注損傷；超氧化物歧化酶；丙二醛

心肌缺血再灌注損傷(MIRI)在血流恢復重建的再灌注過程加劇代謝紊亂，引起心肌超微結構破壞的損傷過程〔1〕。關于MIRI的病理生理及機制較為復雜，包括氧自由基機制，炎癥反應浸潤，能量代謝障礙、微血管通透性機制等。

銀杏葉提取物(GBE)是較為安全的草藥補充劑，研究表明其可明顯改善外周及腦的微循環〔2〕，甚至在MIRI過程中具有明顯的保護作用。目前標準化的GBE為銀杏761，其成分包括大約24%黃酮苷、6%萜烯內酯和其他化學物質〔3〕。其主要生物活性組件的主要藥理作用包括清除氧自由基、抑制血小板聚集和因子和保護微血管內皮細胞。但是GBE是否對大鼠MIRI具有保護作用及其具可能的機制目前尚未研究，本文依據參考文獻建立大鼠MIRI模型，并利用超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)來反映機體氧化還原水平，探討銀杏葉提取物對大鼠MIRI的作用及可能的抗氧化應激機制。

1 材料及方法

1.1 實驗動物 健康成年雄性SD大鼠30只，體重(220±20)g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供。

1.2 藥品、試劑及儀器 GBE購自中國藥品生物鑒定研究所(純度99%)；羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)、伊文思藍、三苯基氯化四氮唑購于sigma公司；由TaKaRa大連寶生物有限公司提供Trizol試劑、熒光定量檢測試劑盒、逆轉錄試劑盒；由上海生工生物工程有限公司完成引物設計與合成。由廈門慧嘉生物有限公司提供SOD、MDA、GSH-Px試劑盒。

1.3 分組 應用隨機數字表法將30只健康Wistar雄性大鼠隨機分為假手術組(Sham)，缺血再管組(I/R組)，GBE組，每組10只。GBE組：造模前1 w給予0.5% GBE 50 mg/kg灌胃，而對Sham組及I/R組給予灌服0.5%CMC-Na 10 ml/kg。

1.4 MIRI模型制備 參考文獻〔4〕的方法建立MIRI模型。各組大鼠術前禁食6 h。對大鼠實施腹腔注射麻醉(20%烏拉坦按8 ml/kg)，仰臥位固定，利用Medlab采集系統記錄Ⅱ導聯心電圖。正中切口切開頸部后氣管插管，并連接小動物呼吸機進行機械通氣，選擇頻率65次/min，呼∶吸比為2∶1，選擇潮氣量為8 ml/kg。剪開胸部皮膚后暴露3～4肋間肌肉，剪斷第4肋骨，刺破胸膜進入胸腔，暴露心臟，將心包膜剪開后將心臟擠出胸腔，結扎冠脈左前降支，造成急性心肌缺血模型。心電圖提示心率減慢，并出現寬大畸形的QRS波群，大鼠左室前壁出現充血、發紺，表示結扎成功。缺血30 min后給予恢復血流，心電圖提示QRS波群回落，提示再灌注成功。給予再灌注120 min。Sham組只穿線不結扎冠脈，其余操作均與余兩組相同。再灌注結束后，從腹主動脈取血，離心，凍存，進行后期血清學檢測。

1.5 利用氯化三苯基四氮唑(TTC)染色測定心肌梗死面積 再灌注結束時，注入2 ml 2%伊文藍向左心室，離體取標本后凍存，橫向切片后，置于1%TTC磷酸鹽緩沖液中浸泡，37℃條件下孵化染色20 min，4%多聚甲醛中固定，采用圖像分析軟件image-proplus6.0測定藍色、紅色、白色區域面積。藍紅白的面積之和為左心室面積(LV)，紅白之和為缺血面積(AAR)，白色面積為梗死面積(IS)。AAR百分比=AAR/LV；IS百分比=IS/AAR。

1.6 血清SOD、MDA含量的檢測 采用硫代巴比妥酸法測定血清中MDA 的含量；采用黃嘌呤氧化酶法測SOD含量；采用二硫代二硝基甲苯胺法測定血中GSH-Px含量。操作步驟嚴格按照說明書進行。

1.7 統計學方法 應用SPSS17.0軟件進行單因素方差分析、LSD-t檢驗。

2 結 果

2.1 各組大鼠形態學比較 Sham組可見心肌細胞排列整齊，各結構完整，細胞核均勻分布；I/R組部分心肌細胞壞死，細胞之間界限欠清，細胞水腫，排列紊亂；GBE組細胞小部分結構模糊，細胞界限尚清晰，輕度水腫。見圖1。I/R組、GBE組大鼠心肌梗死面積〔(22.130 5±2.023 9)%、(13.721 1±0.766 2)%〕，顯著高于Sham組(0%)，且GBE組低于I/R組(均P<0.01)。

2.2 各組大鼠血清SOD、MDA及GSH-Px水平比較 與Sham組比較，I/R組SOD活力及GSH-Px含量顯著降低，MDA水平顯著增高，GBE組與I/R組比較，血清SOD、GSH-Px含量升高，MDA水平降低(均P<0.05)；GBE與Sham組相比較差異均無統計學意義(P>0.05)。見表1。

圖1 各組大鼠心肌組織組織形態學比較(×400)

表1 各組大鼠血清SOD、MDA和 GSH-Px水平比較

與Sham組比較:1)P<0.05；與I/R組比較:2)P<0.05

3 討 論

目前關于MIRI的病理生理及機制較為復雜，包括氧自由基機制、炎癥反應浸潤、能量代謝障礙、微血管通透性機制等。近來微血管通透機制方面成為研究熱點，成為預防MIRI損傷性疾病新的治療方向。

最近研究發現，在MIRI過程，氧化應激是心臟內皮細胞障礙的主要原因，氧化應激引起活性氧簇(ROS)增加，從而導致脂質過氧化反應，氧化蛋白質失活及DNA損傷等〔5〕，同時亦可刺激下游信號通路誘導各種生物效應，如促發凋亡、促發炎癥反應等。既往體外實驗研究證實〔6〕，細胞低氧復氧后也有發生這一病理生理反應。人們已經發現，由ROS誘導的DNA損傷可以通過增加自身磷酸化激活毛細血管擴張共濟失調癥突變蛋白(ATM)激酶〔1〕，反過來觸發的磷酸化啟動后磷酸化p53基質蛋白〔7～9〕。從而抑制氧化應激的損傷。缺血再灌注激活了ROS相關的酶，從而激活腺嘌呤——次黃嘌呤代謝途徑，增加氧自由基的病理產生含量異常。而氧自由基對組成生物膜的不飽和脂肪酸具有很高的親和力，從而激發鏈式脂質過氧化反應，細胞膜性結構等發生脂類過氧化反應，引起線粒體酶活性降低，而細胞膜、溶酶體膜的通透性升高，引起細胞膨脹破裂。當這一反應遇到抗氧化物時，損傷效應就會終止。MDA是一種在缺血再灌注損傷病理過程中產生的脂質過氧化物，其含量高低可直接反映機體內脂質過氧化程度。而SOD是清除氧自由基的最主要物質，其高低可反映機體清除氧自由基的能力。GSH-Px可以清除由活性氧和·OH誘發的脂質過氧化物，保護細胞膜結構和功能的完整性，其活力大小可以反映機體氧化還原反應。GBE是一種草藥補充劑，可明顯改善外周及腦的微循環，甚至在MIRI過程中，具有明顯的保護作用。目前標準化的GBE為銀杏761，其成分包括大約24%黃酮苷、6%萜烯內酯和其他化學物質〔3〕。其主要生物活性組件的主要藥理作用包括清除氧自由基、抑制血小板聚集和因子和保護微血管內皮細胞〔10～12〕。但是GBE是否對大鼠MIRI具有保護作用及其對機體抗氧化反應目前尚未研究。本研究結果表明，GBE 761對大鼠MIRI具有明顯保護作用。血清學結果表明，GBE可明顯抑制大鼠體內的氧化應激反應，并提高大鼠血清中SOD活性。

1 Bencokova Z，Kaufmann MR，Pires IM，etal.ATM activation and signaling under hypoxic conditions〔J〕.Mol Cell Biol，2009；29(2)：526-37.

2 Ribatti D，Nico B，Vacca A，etal.Endothelial cell heterogeneity and organ specificity〔J〕.J Hematother Stem Cell Res，2002；11(1)：81-90.

3 〔No authors listed〕.EGb 761：ginkgo biloba extract，Ginkor〔J〕.Drugs，2003；4(3)：188-93.

4 Gerritsen ME.Functional heterogeneity of vascular endothelial cells〔J〕.Biochem Pharmacol，1987；36(17)：2701-11.

5 Holt RR，Actis-Goretta L，Momma TY，etal.Dietary flavanols and platelet reactivity〔J〕.J Cardiovasc Pharmacol，2006；47(2)：S187-96.

6 Kawano H，Hayashida T，Ohtani H，etal.Histopathological findings of the no-reflow 309phenomenon following coronary intervention for acute coronary syndrome〔J〕.Int Heart J，2005;46(2):327-32.

7 Makovski A，Yaffe E，Shpungin S，etal.Down-regulation of Fer induces ROS levels accompanied by ATM and p53 activation in colon carcinoma cells〔J〕.Cell Signal,2012;24(7):1369-74.

8 Maulik SK，Kumari R，Maulik M，etal.Effect of flavone in a canine model of myocardial stunning〔J〕.Indian J Exp Biol，1999；37(10)：965-70.

9 McDouall RM，Batten P，McCormack A，etal.MHC class Ⅱ expression on human heart microvascular endothelial cells：exquisite sensitivity to interferon-gamma and natural killer cells〔J〕.Transplantation，1997；64(8)：1175-80.

10 Miyashita T，Reed JC.Tumor suppressor p53 is a direct transcriptional activator of the human bax gene〔J〕.Cell，1995；80(2)：293-9.

11 Ning XH，Chi EY，Buroker NE，etal.Moderate hypothermia (30 degrees C) maintains myocardial integrity and modifies response of cell survival proteins after reperfusion〔J〕.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2007；293(4)：H2119-28.

12 Olmez I，Ozyurt H.Reactive oxygen species and ischemic cerebrovascular disease〔J〕.Neurochem Int，2012；60(2)：208-12.

〔2017-04-11修回〕

(編輯 袁左鳴/滕欣航)

吳黎明(1956-)，男，主任醫師，碩士生導師，主要從事心臟內科疾病研究。

鄢曉平(1972-)，女，副主任醫師，主要從事臨床醫學研究。

R54

A

1005-9202(2017)13-3177-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.13.023