β-腎上腺素受體介導運動訓練對老年大鼠心臟缺血預處理效應的影響

吳 芹 宋祥和 郝 玲 王運剛 丁鳳云

(鹽城衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學院，江蘇 鹽城 224005)

β-腎上腺素受體介導運動訓練對老年大鼠心臟缺血預處理效應的影響

吳 芹 宋祥和 郝 玲 王運剛 丁鳳云

(鹽城衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學院，江蘇 鹽城 224005)

目的 探討運動訓練能否恢復老年大鼠心臟缺血預處理(IP)效應及β-腎上腺素受體(β-AR)的可能作用機制。方法 健康雄性SD成年或老年大鼠，實驗分組：成年對照組、老年對照組和老年運動組，每組20只。老年運動組大鼠每天負重5%游泳，5次/w，持續(xù)90 d。離體心臟灌流行IP和(或)缺血再灌注(I/R)，使用不同β-腎上腺素受體激動劑或阻滯劑，分離單個心肌細胞，測心肌細胞收縮幅度、存活率等。結(jié)果 長期運動訓練使老年鼠左心室重量增加顯著，左心室/體重比顯著增加(P<0.05)。IP顯著改善I/R損傷的成年大鼠和長期運動訓練老年鼠的心功能，左心室收縮壓(LVSP)、±dp/dtmax升高，左心室舒張末壓(LVEDP)顯著降低；提高了成年鼠和運動訓練老年鼠的心肌細胞收縮幅度，但不能提高老年對照鼠心肌細胞收縮幅度；提高了成年鼠和運動訓練老年鼠的心肌細胞存活率，但不能提高老年對照鼠心肌細胞存活率。IP時阻斷β1-AR，IP不能恢復三組大鼠的心肌細胞收縮幅度；阻斷β2-AR，IP能夠恢復成年鼠，卻不是老年對照鼠和運動訓練老年鼠的心肌細胞收縮幅度。結(jié)論 IP可部分恢復運動訓練老年大鼠的I/R損傷的心功能，其可能機制不僅涉及β1-AR的作用，β2-AR發(fā)揮著更為特別的作用。

運動訓練；缺血預處理；β-腎上腺素受體

心血管疾病是目前老年人死亡、喪失勞動能力的主要因素。因此，尋求新的藥物或干預措施限制梗死心肌面積、阻止細胞凋亡顯得尤為重要。研究表明，老年心臟失去了缺血預處理(IP)的保護作用〔1〕。運動訓練被認為是彌補老年心臟生理學和解剖學改變的有效措施。本研究觀察運動訓練能否恢復IP對老年心臟的保護作用及可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 正常健康SD大鼠，成年鼠6月齡，老年鼠24月齡，雌雄不拘，清潔級，購自徐州醫(yī)學院實驗動物中心。實驗設(shè)計經(jīng)鹽城衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學院實驗動物倫理委員會批準。老年大鼠分為老年對照組和老年運動組，老年運動組每天負重5%游泳，5次/w，持續(xù)90 d。各組常規(guī)飼養(yǎng)，90 d后實驗。

1.2 離體心臟灌流和心肌細胞分離 每組隨機取10只大鼠稱重，腹腔注射5 000 IU/kg肝素，約10 min后，頸椎脫臼處死，迅速開胸取心，參照文獻〔2〕把主動脈插入Langendorff灌注架上，用線結(jié)扎固定。經(jīng)房室瓣插入帶球囊的心導管抵左心室，通過MacLab生物信號采集軟件檢測左心室收縮壓(LVSP)、左心室舒張末壓(LVEDP)、左心室內(nèi)壓上升和下降的最大變化速率(±dp/dtmax)。穩(wěn)定20 min后，隨機分組：①對照組：穩(wěn)定后，持續(xù)灌注80 min，不作處理；②缺血再灌注(I/R)組：穩(wěn)定后，持續(xù)灌注20 min，不作處理；③IP組：穩(wěn)定后，停灌5 min，復灌5 min，循環(huán)4次；④異丙腎上腺素(ISO)處理組：穩(wěn)定后，含10 nmol/L ISO的K-H液灌 5 min，洗脫5 min；⑤IP+CGP20712A組(IP+CGP組)：心臟IP前5 min起，整個過程均使用300 nmol/L的CGP20712A；⑥IP+ICI118551組(IP+ICI組)：心臟IP前5 min起，整個過程均使用55 nmol/L的ICI118551。各組按上述方法處理后，均行關(guān)泵停灌30 min，再用100%O2飽和的K-H液復灌30 min。然后，酶法分離得單個心室肌細胞，按約2×104cells/well接種于無血清高糖DMEM(Hyclone公司)，置CO2培養(yǎng)箱(德國Heraeus公司)中孵育2 h測定心肌細胞收縮幅度。

1.3 心臟重量測定 另每組10只大鼠，頸椎脫臼處死后，立即取心臟置濾紙上，吸干血跡。稱取心臟重量(HW)，剪下左心室并稱重(LVW)。計算左室質(zhì)量指數(shù)=LVW/體重(BW)。

1.4 心肌細胞收縮幅度測定 收集心肌細胞置于收縮功能分析裝置的細胞浴槽內(nèi)，用蠕動泵將含有2.0 mmol/L鈣和100 nmol/L濃度的ISO(Sigma公司) 的K-H液，循環(huán)至細胞槽內(nèi)，然后用刺激器對細胞進行刺激(0.5 Hz，37℃)。用心肌細胞收縮軟件分析，得到心肌細胞收縮幅度的變化〔3〕。

1.5 心肌細胞存活率的測定 在鏡下計數(shù)一定數(shù)量的心肌細胞，其中長桿狀細胞占總細胞的比率作為心肌細胞的存活率，用百分比(%)表示。每一組選5個視野，共計數(shù)200 個細胞。此步驟由一對實驗不知情者進行。

1.6 統(tǒng)計學方法 使用GraphPad Prism4.0 分析軟件，兩組間比較用t檢驗，方差不齊用校正t檢驗；多組間的比較采用方差分析(ANOVA)。

2 結(jié) 果

2.1 年齡和運動訓練對大鼠BW和LVW的影響 老年大鼠BW顯著增加，與成年鼠相比，HW、LVW〔老年對照組(2.05±0.48)mg/g、成年對照組(1.94±0.97)mg/g、老年運動組(2.27±0.87)mg/g〕均顯著增加(P<0.05)。老年運動鼠與成年鼠相比，年齡對BW、HW、LVW影響仍存在(P<0.05)。長期運動訓練使老年鼠BW增加沒有對照老年鼠明顯(P>0.05)，但HW、LVW增加顯著(P<0.05)。見表1。

表1 各組BW與LVW的比較

與成年對照組比較：1)P<0.05；與老年對照組比較：2)P<0.05

2.2 不同灌注條件下各組血流動力學參數(shù)的比較 正常灌注條件下，三組血流動力學參數(shù)無顯著差異(P>0.05)。I/R使各組大鼠心功能均受損，表現(xiàn)為LVSP、±dp/dtmax降低，LVEDP升高(均P<0.05)。老年對照組損傷尤為嚴重，與正常灌注相比，I/R后LVSP、±dp/dtmax分別下降了53.49%、50.98%和58.44%，而LVEDP卻增加了4.54倍。長期運動訓練對保存老年鼠抗I/R損傷能力有一定作用，僅LVSP有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。IP顯著改善I/R損傷的成年大鼠和長期運動訓練老年鼠的心功能，LVSP、±dp/dtmax升高，LVEDP顯著降低(P<0.05)。老年對照組雖然經(jīng)歷了IP，卻不能改善I/R損傷后的心功能。老年對照組經(jīng)歷IP后，LVSP、±dp/dtmax分別恢復了60.46%、64.28%和58.68%，LVEDP是正常灌注條件下的4.34倍。見表2。

表2 各組不同灌注條件下的血流動力學參數(shù)變化±s)

與正常灌注比較：1)P<0.05；與I/R比較：2)P<0.05；與成年對照組比較：3)P<0.05；與老年對照組比較：4)P<0.05，下表同

2.3 不同灌注條件下各組大鼠單個心肌收縮幅度比較 I/R條件下，與成年鼠相比，老年鼠心肌細胞收縮幅度顯著降低(P<0.05)。但長期運動訓練老年鼠心肌細胞收縮幅度與成年鼠相比沒有顯著差異(P>0.05)。IP顯著提高了成年鼠和運動訓練老年鼠的心肌細胞收縮幅度，但不能提高老年對照鼠心肌細胞收縮幅度。正常灌注條件下，三組大鼠心肌細胞收縮幅度無顯著差異(P>0.05)。見表3。

2.4 不同灌注條件下各組大鼠心肌細胞存活率的變化 與成年鼠相比，I/R條件下，老年鼠心肌細胞存活率顯著降低〔(41.78±9.64)% vs (52.47±10.52)%,P<0.05〕。但長期運動訓練老年鼠心肌細胞存活率與成年鼠相比沒有顯著差異〔(48.68±9.67)%，P>0.05〕。IP顯著提高了成年鼠和運動訓練老年鼠的心肌細胞存活率，但不能提高老年對照鼠心肌細胞存活率〔(77.02±13.05)%、(46.82±8.41)%、(70.76±8.36)%〕。

2.5 激活或阻斷β-腎上腺素受體(β-AR)后各組大鼠心肌細胞收縮幅度的變化 ISO模擬IP，激活β-AR后，無論是成年鼠、老年對照鼠還是運動訓練老年鼠，心肌細胞收縮幅度均顯著高于I/R組(P<0.05)，與正常灌注相比無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。IP時阻斷了β1-AR，IP不僅不能恢復老年對照鼠的心肌細胞收縮幅度，也不能恢復成年鼠和運動訓練老年鼠的心肌細胞收縮幅度。IP時阻斷了β2-AR，IP恢復了成年鼠的心肌細胞收縮幅度，卻不能恢復老年對照鼠和運動訓練老年鼠的心肌細胞收縮幅度。見表3。

表3 激動或阻斷β-AR后各組大鼠在不同灌注條件下心肌細胞收縮幅度比較±s，%)

3 討 論

IR是心臟最有力的抗I/R損傷的內(nèi)源性保護機制，但隨著年齡的增加，這種作用逐漸失去。其中原因涉及多種介質(zhì)，如：腺苷受體、去甲腎上腺素、緩激肽等。Abete等〔3〕發(fā)現(xiàn)，IP降低了成年大鼠和訓練老年大鼠心臟缺血后功能失調(diào)，與增加了去腎上腺素釋放有關(guān)，運動訓練可以通過增加去甲腎上腺素釋放恢復老年大鼠心臟預處理效應。Corbi等〔4，5〕發(fā)現(xiàn)，β-腎上腺素刺激或運動訓練均能降低心率、心肌收縮力、心輸出量和射血分數(shù)。在高強度運動情況下，年老導致心率下降與盡管循環(huán)水平兒茶酚胺水平升高，但β-腎上腺素反應性降低有關(guān)。本實驗研究發(fā)現(xiàn)IP可部分恢復運動訓練老年大鼠的I/R損傷的心功能，其可能機制不僅涉及β1-AR的作用，β2-AR發(fā)揮著更為特別的作用。

早在1993年，B?hm等〔6〕就研究發(fā)現(xiàn)，與成年大鼠相比，老年大鼠心肌膜上ISO激活的AC活性下降，伴隨著15%的百日咳毒素結(jié)合位點增加，72%的免疫測定的Giα蛋白增加。中等強度的跑步訓練降低了成年和老年大鼠心肌膜上30%～35%的Giα蛋白，但是僅提高了老年大鼠心肌膜上的ISO刺激的AC活性，還提高成年大鼠基礎(chǔ)的、Gpp(NH)p(一種真核細胞有力的AC激活劑)及ISO刺激的AC活性。本課題組先前研究發(fā)現(xiàn)〔2〕，短暫使用非選擇性β-ARs激動劑ISO可模擬IP，0.02 μmol/L ISO顯著降低再灌時冠脈流出液中肌酸激酶(CK)的釋放，保存了冠脈流量(MCF)和心率血壓乘積(RPP)。普萘洛爾(1 μmol/L)或阿替洛爾(10 μmol/L)，一種β1-AR阻斷劑，而不是高選擇性β2-AR阻斷劑ICI 118551(2 μmol/L)，完全抑制了ISO預處理的作用。這些結(jié)果表明，β-ARs介導大鼠心臟IP效應，β1-AR起主要作用。本研究發(fā)現(xiàn)，IP時阻斷了β1-AR，IP不僅不能恢復老年對照鼠的心肌細胞收縮幅度，也不能恢復成年鼠和運動訓練老年鼠的心肌細胞收縮幅度，說明β1-AR在IP部分恢復運動訓練老年大鼠的I/R損傷的心功能中發(fā)揮重要作用。Leosco等〔7〕發(fā)現(xiàn)，運動訓練和β腎上腺素阻斷劑能夠改善老年心臟的β-AR信號，促進β-AR反映和相應的左心室正性肌力儲備。Tong 等〔8〕以小鼠為模型，發(fā)現(xiàn)ISO在小鼠心臟也能誘導心臟保護作用，且被PTX(Gi抑制劑)阻斷；但在β2-AR基因敲除小鼠卻沒有作用，認為IP通過β2-AR-Gi激活介導的。本課題組先前研究發(fā)現(xiàn)，自主運動訓練依賴β2-AR改變保護心功能〔9〕。本研究發(fā)現(xiàn)，β2-AR在IP部分恢復運動訓練老年大鼠的I/R損傷的心功能中發(fā)揮著更為特別的作用。

Ferrara等〔10〕綜述，分析相關(guān)機制發(fā)現(xiàn)，β2-AR激活時同時與Gs和Gi耦聯(lián)，Gi通路對Gs通路信號向細胞內(nèi)的擴散起屏蔽作用，從而使β2-AR激活出現(xiàn)不同于β1-AR激活的功能特性。而且，B?hm等〔6〕還發(fā)現(xiàn)運動訓練或年老對β-AR數(shù)量沒有作用，提高Giα表達可能是導致老年心肌cAMP 形成降低的一個機制。在沒有β-AR改變的前提下，Giα可能是生理病理狀態(tài)下心臟AC的調(diào)節(jié)器。當然，在2011年，Calvert等〔11,12〕研究發(fā)現(xiàn)，運動訓練保護I/R損傷的心肌是通過刺激β3-AR，提高NO代謝物的儲備實現(xiàn)的。綜上所述，IP恢復運動訓練老年大鼠的I/R損傷的相關(guān)機制還有待進一步研究。

1 Boengler K，Schulz R，Heusch G.Loss of cardioprotection with ageing〔J〕.Cardiovasc Res，2009；83(2)：247-61.

2 吳 芹，趙 智，孫 紅，等.缺血預處理通過β2-腎上腺素受體保護心肌細胞收縮功能〔J〕.生理學報，2008；60(3)：327-32.

3 Abete P，Calabrese C，F(xiàn)errara N，etal.Exercise training restores ischemic preconditioning in the aging heart〔J〕.J Am Coll Cardiol，2000；36(2)：643-50.

4 Corbi G，Conti V，Russomanno G，etal.Adrenergic signaling and oxidative stress：a role of sirtuins〔J〕. Front Physiol，2013；4(8)：324.

5 Corbi G，Bianoc A，Turchiarelli V，etal.Potential mechanisms linking atherosclerosis and increased cardiovascular risk in COPD：focus on sirtuins〔J〕.Int J Mol Sci，2013；14(6)：12696-713.

6 B?hm M，Dorner H，Htun P.Effects of exercise on myocardial adenylate cyclase and Gi alpha expression in senescence〔J〕.Am J Physiol，1993；264(3 Pt 2)：H805-14.

7 Leosco D，Rengo G，Laccarino G，etal.Exercise training and beta-blocker treatment ameliorate age-dependent impairment of beta-adrenergic recepter signaling and enhance cardiac responsiveness to adrenergic stimulation〔J〕.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2007；293(3)：H1596-603.

8 Tong H，Bernstein D，Murphy E，etal.The role of beta-adrenergic receptor signaling in cardioprotection〔J〕.FASEB J，2005；19(8)：983-5.

9 吳 芹，李仕紅，唐成和，等.自主運動通過β2-腎上腺素受體調(diào)節(jié)大鼠心功能〔J〕.江蘇醫(yī)藥，2011；37(19)：2245-7.

10 Ferrara N，Komici K,Corbi G.β-adrenergic receptor responsivenesss in aging heart and clinical implications〔J〕.Clin Translat Physiol，2014；4(396)：1-10.

11 Calvert JW，Condit ME，Aragón JP，etal.Exercise protects against myocardial ischemia-reperfusion injury via stimulation of β3-adrenergic receptors and increased nitric oxide signaling：role of nitrite and nitrosothiols〔J〕.Circ Res,2011；108：1448-58.

12 Calvert JW，Lefer DJ.Role of β-adrenergic receptors and nitric oxide signaling in exercise-mediated cardioprotection〔J〕.Physiology，2013；28：216-24.

〔2015-12-15修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢園)

鹽城市醫(yī)學科技發(fā)展計劃項目(No.YK2011121)

丁鳳云(1963-)，女，教授，主要從事心血管功能調(diào)控研究。

吳 芹(1974-)，女，碩士，副教授，主要從事心血管功能調(diào)控研究。

R331

A

1005-9202(2017)13-3164-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.13.019