益心酮片對亞急性酒精性肝損傷大鼠氧化應激的影響

李素婷 王 冉 杜 超 高玉峰 吳曉光

(承德醫學院生化教研室，河北 承德 067000)

益心酮片對亞急性酒精性肝損傷大鼠氧化應激的影響

李素婷 王 冉 杜 超 高玉峰 吳曉光

(承德醫學院生化教研室，河北 承德 067000)

目的 研究益心酮片對亞急性酒精性肝損傷大鼠氧化應激的影響。方法 選擇雄性SD大鼠60只，隨機分為正常組、模型組、益心酮低、高劑量組和維生素E組。以56°北京二鍋頭白酒連續灌胃4 w建立大鼠亞急性酒精性肝損傷模型，造模同時每天按劑量(100、200 mg/kg)給予益心酮干預，檢測血清丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉移酶(AST)活性，肝組織丙二醛(MDA)、還原型谷胱甘肽(GSH)含量，超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性，并進行肝臟病理學觀察。結果 益心酮能明顯降低大鼠血清ALT、AST活性，提高肝組織SOD、GSH、GSH-Px活性，降低MDA含量，并能減輕酒精引起的肝組織病理損傷。結論 益心酮可能通過提高內源性抗氧化能酶活性，抑制大鼠肝臟氧化應激損傷保護酒精性肝損傷。

益心酮；酒精性肝損傷；氧化應激

酒精性肝病是長期或大量飲酒所引起的肝臟損害〔1〕。酒精性肝病發病機制復雜，酒精及其代謝產物的毒性作用、氧化應激、細胞凋亡、免疫反應、腸源性內毒素、遺傳因素等多種因素參與其發生發展〔2〕。目前研究認為，過量飲酒時酒精在肝臟代謝產生的活性氧(ROS)所引起的氧化應激是引起酒精性肝病的一個重要原因〔3〕。迄今為止，國內外對酒精性肝病尚無有效的干預措施，而中藥具有多靶點、多層次、多途徑及協調作用等特點，在抑制氧化應激，防治酒精性肝病方面具有一定的應用價值〔4〕。山楂葉總黃酮是一種天然的植物提取物，因富含黃酮類成分而具有明顯的清除自由基、抗氧化、抗腫瘤、抗病毒調節免疫、保肝等廣泛的藥理作用〔5〕，其制劑益心酮片作為降血脂、預防心腦血管供血不足用藥應用于臨床。本研究觀察益心酮對酒精所致大鼠肝臟氧化應激損傷的保護作用及可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級健康雄性SD大鼠60只，體重(180±20)g，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，合格證號：scxk(2007-2009)。適應性飼養1 w后進行實驗，實驗期間自由飲水及進食普通飼料。

1.2 藥品、試劑及實驗儀器 益心酮片(山楂葉總黃酮制劑，每片含山楂葉總黃酮32 mg)：購于山西振東泰盛制藥有限公司，臨床應用2～3片/次，3次/d，即192～288 mg/d，以成人體重60 kg 計算，相當3.2～4.8 mg/kg。本實驗給大鼠灌胃100、200 mg/kg，約為成人用量的20～40倍，臨用前用蒸餾水將益心酮片配置成不同濃度的混懸液；56°紅星二鍋頭白酒：北京紅星釀酒廠生產；丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉移酶(AST)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、還原型谷胱甘肽(GSH)測定試劑盒:南京建成生物工程研究所。半自動生化分析儀(MD-100)：美國Bayer公司；721W微機型分光光度計：上海光學儀器五廠；Olympus顯微鏡和組織切片機：德國Leica公司。

1.3 方法

1.3.1 動物分組及給藥〔6〕60只雄性SD大鼠隨機分為正常組、模型組、益心酮低、高劑量(100、200 mg/kg)組和維生素E(100 mg/kg)組。正常組每天給予蒸餾水0.4 ml灌胃，其余各組每天上午按16 ml/kg劑量灌胃56°白酒1次，連續灌胃4 w造模結束。自造模第1天起，益心酮低、高劑量組在每天灌胃白酒1 h后，灌胃益心酮混懸液，維生素E組給予維生素E橄欖油溶液，正常組和模型組灌服等體積蒸餾水，實驗期間各組大鼠自由飲水、進食。最后一次灌胃結束，禁食不禁水16 h，乙醚麻醉大鼠，剖腹取血、肝組織備用。

1.3.2 指標檢測 取血分離血清，半自動生化分析儀測定ALT、AST活性；取部分肝組織，用冷生理鹽水沖洗后制備成10%的肝勻漿，按試劑盒說明書測定肝組織SOD、GSH、GSH-Px活性及MDA的含量。

1.3.3 肝臟病理學檢查 取大鼠肝組織，10%甲醛溶液常規固定，石蠟包埋、切片，HE染色，光學顯微鏡下觀察肝組織病理學變化。

1.4 統計學方法 應用SPSS17.0統計軟件進行單因素方差分析，兩組比較采用SNK法。

2 結 果

2.1 益心酮對酒精性肝損傷大鼠血清ALT、AST活性的影響 模型組大鼠血清ALT、AST活性均顯著升高，和正常組比較有顯著差異(P<0.05)；和模型組比較，益心酮低、高劑量組和維生素E組均能明顯降低大鼠血清中ALT、AST活性(P<0.05，P<0.01)，表明益心酮能夠保護大鼠肝細胞、穩定細胞膜結構，對酒精性肝損傷具有一定的保護作用，且維生素E組效果優于益心酮組。見表1。

2.2 益心酮對肝組織SOD、GSH、GSH-Px活性及 MDA含量的影響 與正常組比較，模型組大鼠肝組織MDA含量明顯升高，SOD、GSH、GSH-Px活性明顯降低(P<0.01)；與模型組相比，益心酮低、高劑量組和維生素E組均可降低大鼠肝組織MDA含量，升高SOD、GSH、GSH-Px活性(P<0.05)。益心酮低、高劑量組之間比較，GSH、GSH-Px有顯著差異(P<0.05)，SOD、MDA無明顯差異。而維生素E組和益心酮各劑量組比較，MDA、SOD、GSH、GSH-Px均有顯著差異(P<0.05)。表明益心酮能提高內源性抗氧化劑水平，具有清除自由基抗脂質過氧化反應的能力，并具有劑量依賴性。但抗脂質過氧化作用效果較弱于維生素E。見表1。

2.3 肝組織病理學變化 各組大鼠肝組織HE染色后光鏡下觀察，正常組：肝小葉結構清晰，肝細胞形態正常，肝索排列整齊，肝組織無明顯脂肪變性，肝小葉內未見肝細胞壞死及淋巴細胞浸潤；模型組：肝小葉結構不清，可見點狀、灶狀壞死，肝細胞彌漫性腫脹，并有片狀脂肪樣變性，在匯管區有可見有炎癥細胞浸潤。益心酮各劑量組：肝小葉結構基本保留，肝細胞輕度水腫，脂肪樣變性細胞明顯減少，肝小葉內可見少量點狀壞死及淋巴細胞浸潤；維生素E組：肝小葉結構基本正常，肝細胞水腫及脂肪樣變性明顯減少，肝小葉內偶見少量點狀壞死及淋巴細胞浸潤。見圖1。

表1 益心酮對各組大鼠血清ALT、AST活性及肝臟SOD、GSH、GSH-Px活性、MDA含量的影響

與正常組比較:1)P<0.01；與模型組比較:2)P<0.05，3)P<0.01；與益心酮低劑量組比較:4)P<0.05；與維生素E組比較:5)P<0.05

圖1 益心酮對酒精性肝損傷大鼠肝組織病理改變的影響(HE，×200)

3 討 論

酒精過量攝入已成為我國病毒性肝炎之后導致肝臟損傷的第二大病因〔1〕。對我國人民身體健康和社會發展構成了嚴重威脅。研究表明，酒精在肝臟代謝過程中產生氧化應激是導致酒精性肝損傷最重要的一個原因〔7〕。大量飲酒后，酒精在肝臟經肝微粒體乙醇氧化系統(MEOS)代謝產生大量自由基(如：O2-·、OH-·、H2O2等)，這些自由基具有極強的氧化能力，可攻擊肝細胞膜多不飽和脂肪酸發生脂質過氧化反應，破壞細胞膜和細胞器結構，改變膜流動性和通透性，影響DNA和蛋白質的結構和功能，并可引起肝內ATP和GSH耗竭，導致肝細胞廣泛損傷〔8〕。脂質過氧化的代謝終產物MDA還可刺激機體產生抗體引起相應免疫應答，誘導炎癥細胞因子基因的表達，進一步加重酒精性肝損傷〔9〕。機體在代謝酒精時會啟動內源性抗氧化系統來干預氧化應激損傷，SOD是清除活ROS的主要的抗氧化酶，它可將氧自由基歧化為H2O2，H2O2進一步在過氧化氫酶、GSH-Px催化下被清除，保護肝細胞免被損傷。但是大量攝入酒精時，酒精可引起肝細胞內抗氧化物質(維生素E、C、A)明顯減少，進而導致SOD活性下降，不能有效清除自由基，致使自由基在體內蓄積超過體內抗氧化酶代謝的能力，引起細胞膜發生脂質過氧化反應，對肝細胞造成損傷〔10〕。因此檢測肝組織中SOD活性可以衡量肝臟清除自由基能力及機體抗氧化能力。GSH是細胞內游離的水溶性抗氧化劑，GSH-Px是體內廣泛存在的抗脂質過氧化反應酶，GSH-Px特異催化GSH還原體內過氧化代謝產物，阻斷脂質過氧化連鎖反應，減輕過氧化物對細胞膜損傷，保護細胞膜結構和功能的完整性。酒精在肝臟的代謝產物乙醛在對肝細胞產生毒性的同時會與GSH、GSH-Px的巰基結合，加速GSH的耗竭，抑制GSH-Px活性，使內源性抗氧化能力下降，加重肝細胞氧化損傷〔11〕。因此檢測肝組織GSH含量和GSH-Px活性也是衡量酒精性肝損傷時肝臟氧化應激及脂質過氧化程度的重要指標。脂質過氧化的代謝終產物MDA是氧化應激損傷的敏感指標，檢測MDA含量可衡量細胞脂質過氧化損傷的程度〔12〕。

本研究結果說明酒精性肝損傷模型制備成功。酒精誘導大鼠肝臟出現氧化應激反應。益心酮能保護肝細胞，穩定細胞膜的結構和功能，對酒精性肝損傷有一定的保護作用。本研究表明益心酮具有較強的清除自由基抑制脂質過氧化反應的能力，能減少大鼠肝臟內GSH的消耗，增強內源性SOD、GSH-Px等抗氧化酶的抗氧化能力，抑制自由基介導的脂質過氧化反應對肝臟的損傷，對酒精性肝損傷有確切的保護作用。維生素E是一種公認的抗氧化劑，能清除自由基，提高內源性抗氧化酶活性，抑制酒精誘導的肝臟氧化應激損傷。本研究結果表明，益心酮和維生素E均能提高肝組織SOD、GSH-Px、GSH水平，降低MDA含量，而維生素E的保肝抗氧化能力優于益心酮。

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〔2015-12-22修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢園)

河北省科學技術研究與發展計劃項目(No.12276104D-93)

李素婷(1963-)，女，醫學碩士，教授，碩士生導師，主要從事中藥對肝病防治作用的機制研究。

R575

A

1005-9202(2017)13-3162-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.13.018