山茱萸多糖對阿爾茨海默病模型大鼠認知能力和海馬磷酸化-tau蛋白表達的影響

蘇亞楠 張曉波 姚海濤 陳立強

(佳木斯大學附屬第一醫院，黑龍江 佳木斯 154002)

山茱萸多糖對阿爾茨海默病模型大鼠認知能力和海馬磷酸化-tau蛋白表達的影響

蘇亞楠 張曉波1姚海濤1陳立強1

(佳木斯大學附屬第一醫院，黑龍江 佳木斯 154002)

目的 觀察山茱萸多糖對阿爾茨海默病(AD)大鼠認知能力的影響及作用機制。方法 100只Wistar大鼠隨機分為青年組、假手術組、模型組、多奈哌齊組、山茱萸多糖組各20只。采用D-半乳糖聯合β-淀粉樣蛋白(Aβ)1～40注射建立AD模型。水迷宮實驗觀察大鼠認知能力，免疫組化(SABC)法檢測大鼠海馬CA4區磷酸化tau(p-tau)蛋白表達量。結果 藥物干預后，山茱萸多糖組平均逃避潛伏期較模型組明顯縮短(P<0.05)；120 s穿越原平臺次數較模型組明顯增加(P<0.05)。山茱萸多糖組海馬區p-tau蛋白陽性染色較模型組明顯減弱(P<0.05)。結論 山茱萸多糖對AD大鼠認知能力有改善，可能與降低海馬區p-tau蛋白表達量相關。

山茱萸多糖；阿爾茨海默病；磷酸化tau蛋白；認知能力

山茱萸多糖是我國傳統中藥材山茱萸生物學活性物質的重要成分，現已明確其成分主要有木糖和葡萄糖組成的多糖(PFCC)，鼠李糖、阿拉伯糖和葡萄糖組成的多糖(PFCAⅢ)等〔1〕。研究顯示〔2〕多糖有抗氧化、調節和增強免疫功能、抗衰老、保護心腦血管系統等作用。本實驗觀察β-淀粉樣蛋白(Aβ)1～40誘導制備阿爾茨海默病(AD)大鼠模型經山茱萸多糖干預后學習記憶能力改變、磷酸化tau(p-tau)蛋白表達變化及其作用機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物和分組 清潔級Wistar大鼠100只，3月齡，體重(137.4±12.7)g。常規飼養，隨機分為青年組、假手術組、模型組、多奈哌齊組、山茱萸多糖組，每組20只。

1.2 主要試劑 山茱萸多糖提取物(4∶1)購自朗林生物制品有限公司；Aβ1～40購自無錫亞肽生物科技有限公司；多奈哌齊由法國輝瑞公司生產；兔抗大鼠p-tau抗體(pSer422)由Sigma-Aldrich公司生產；免疫組化(SABC)試劑盒、化學發光底物(ECL)試劑盒由武漢博士德生物工程有限公司生產。

1.3 模型制備和給藥 按60 mg·kg-1·d-1給大鼠腹腔連續注射D-半乳糖。6 w后，山茱萸多糖組、多奈哌齊組、模型組大鼠固定在腦立體定位儀上，依據《大鼠腦立體定位圖譜》〔3〕行海馬區注射凝聚態Aβ1～40溶液1 μl；假手術組海馬區注射等量無菌生理鹽水。術后7 d，山茱萸多糖組以0.175 mg·kg-1·d-1灌胃，多奈哌齊組以0.5 mg·kg-1·d-1灌胃，模型組、假手術組以等量生理鹽水灌胃，1次/d，連續30 d。

1.4 Morris水迷宮檢測 造模后第8天、藥物灌胃30 d各組進行Morris水迷宮實驗。每次共6 d。①定位航行試驗：共5 d，上午和下午兩時段，每個時段訓練4次，以水池4個象限作為大鼠的入水點至找到平臺為止，如大鼠在120 s內找到平臺，平臺停留30 s；如在120 s未找到平臺，將其引至平臺停留30 s。記錄大鼠軌跡路線圖，4個不同象限平均值是該次的逃避潛伏期。②空間探索試驗：第6天撤除平臺，記錄大鼠120 s內穿越原平臺位置次數及在原平臺所在象限停留時間。

1.5 取材和檢測 大鼠灌胃30 d，麻醉后固定于木板平臺上，打開胸腔暴露心臟，將灌注針沿左心室插入主動脈，剪開右心耳，0.9%生理鹽水灌注心臟，至大鼠四肢蒼白；換4%多聚甲醛溶液行心臟灌注。斷頭取腦，腦組織于4%多聚甲醛溶液中固定。于海馬處取材，SABC法檢測海馬p-tau蛋白表達。胞質內呈現陽性的顆粒為陽性表達，圖像采集后用Image-Pro Plus6.0圖像分析軟件來計算圖像中陽性染色的平均光密度值。

1.6 統計學方法 采用SPSS19.0軟件進行單因素方差分析，兩兩比較采用最小顯著性差異法(LSD)和S-N-K檢驗。

2 結 果

2.1 各組逃避潛伏期比較 干預前模型組、多奈哌齊組、山茱萸多糖組逃避潛伏時間較青年組和假手術組明顯延長(均P<0.05)；干預后與模型組比較，青年組、假手術組、多奈哌齊組、山茱萸多糖組明顯縮短(均P<0.05)。見表1。

表1 各組干預前、后平均逃避潛伏期

與青年組、假手術組比較：1)P<0.05；與模型組比較：2)P<0.05

2.2 各組干預前、后空間探索能力比較 與干預前比較，多奈哌齊組(0.368 1±0.010 2)、山茱萸多糖組干預后穿越原平臺次數均明顯增加(P<0.05)。見表2。

2.3 各組海馬p-tau(Ser422)表達 在海馬 CA4區，與青年組(0.316 8±0.011 7)、假手術組(0.319 9±0.013 0)比較，模型組p-tau(Ser422)蛋白(0.402 2±0.014 3)陽性染色明顯增強(P<0.05)。與模型組比較，多奈哌齊組(0.368 1±0.010 2)、山茱萸多糖組p-tau(Ser422)蛋白(0.372 3±0.012 1)陽性染色均明顯減弱(P<0.05)。而多奈哌齊組，山茱萸多糖組p-tau(Ser422)蛋白陽性染色無明顯差別(P>0.05)。見圖1。

表2 各組干預前、后120 s內穿越原平臺次數,次，n=20)

與青年組比較：1)P<0.05；與模型組比較：2)P<0.01，3)P<0.05；與干預前比較：4)P<0.05

圖1 各組海馬CA4區p-tau(Ser422)蛋白表達情況(SABC法，×400)

3 討 論

AD是一種神經退行性疾病，最主要病理特征是老年斑〔4〕和神經纖維纏結(NFTs)〔5，6〕，AD患者癡呆程度與NFTs數量密切相關。tau是神經元中含量最高的微管相關蛋白，tau蛋白被過度磷酸化具有神經毒性〔7，8〕。本實驗表明山茱萸多糖在調節AD大鼠海馬tau蛋白磷酸化中有積極作用，可改善AD大鼠病理進展，達到防治目的。本實驗觀察到大鼠在Morris水迷宮實驗訓練中形成穩定的空間位置認知和空間記憶，從信息加工和提取方式來看屬于陳述性記憶，這種認知和記憶主要儲存在邊緣系統(如海馬)和大腦皮層相關腦區。癡呆病人最先受損且損傷重的是陳述性記憶。研究證明〔9〕，功能未受損的海馬區對空間學習記憶和獲得新信息很重要，Morris〔10〕也證明海馬受損大鼠在水迷宮學習中，隱藏平臺實驗的成績降低。本實驗說明造模大鼠海馬功能受到損害，但這種損害造成海馬區的神經細胞功能性改變和空間學習、記憶間的關系一直沒得到合理解釋。Knierim等〔11〕認為這種關系形態學基礎是由兩種類型神經元組成，一種是定位神經細胞，是構成認知地圖的關鍵因素；一種是方位神經細胞，是構成認知特定方位關鍵因素。有學者〔12〕認為神經元和神經突觸的變化是直接影響AD患者學習、認知和記憶的神經功能基礎。本實驗說明山茱萸多糖對AD大鼠的學習和記憶能力有改善作用，間接證明對海馬區受損神經元和神經突觸功能有修復和保護作用。

1 陳巧霞，楊光明，潘 揚.山茱萸功能性成分的提取分離及生物活性研究進展〔J〕.江蘇中醫藥，2016；48(1)：82-5.

2 楊 雪，季 紅，劉穎男，等.山茱萸多糖提取純化方法及藥理作用研究進展〔J〕.中國老年學雜志，2015；35(8)：1984-6.

3 包新民，舒斯云.大鼠腦立體定位圖譜〔M〕.北京：人民衛生出版社，1991：44.

4 Beach TG，Sue LI，Walker DG，etal.Striatal amyloid plaque density predicts Braak neurofibrillary stage and clinicopathological Alzheimer′s disease：implications for amyloid imaging〔J〕.J Alzheimers Dis，2012；28(4)：869-76.

5 Lasagna-Reeves CA，Castillo-Carranza DL，Sengupta U，etal.Identification of oligomers at early stages of tau aggregation in Alzheimer′s disease〔J〕.FASEB J，2012；26(5)：1946-59.

6 Miyashita A，Hatsuta H，Kikuchi M,etal.Genes associated with the progression of neurofibrillary tangles in Alzheimer′s disease〔J〕.Transl Psychiatry，2014；4：e396.

7 Khan SS，Bloom GS.Tau：the center of a signaling nexus in Alzheimer′s disease〔J〕.Front Neurosci，2016；10：31.

8 H?glund K，Fourier A，Perret-Liaudet A，etal.Alzheimer′s disease--recent biomarker developments in relation to updated diagnostic criteria〔J〕.Clin Chim Acta，2015；449：3-8.

9 Cornwell BR，Overstreet C，Grillon C.Spontaneous fast gamma activity in the septal hippocampal region correlates with spatial learning in humans〔J〕.Behav Brain Res，2014；261：258-64.

10 Morris RG.Developments of a water-maze procedure for studying spatial learning in the rat〔J〕.Neurosci Methods，1984；11(1)：47-60.

11 Knierim JJ，Kudrimoti HS.Learned interaction of visual and idiothetic cues in the control of place field orientation〔J〕.Exp Brain Res，1998；80(1)：135-42.

12 Berchtold NC，Coleman PD，Cribbs DH，etal.Synaptic genes are extensively downregulated across multiple brain regions in normal human aging and Alzheimer′s disease〔J〕.Neurobiol Aging，2013；34(6)：1653-61.

〔2016-07-15修回〕

(編輯 王一涵)

黑龍江省衛生廳項目(2013-233)；佳木斯大學面上項目(L2012-052)；佳木斯大學附屬第一醫院培育課題(jy2014-005)

陳立強(1979-)，男，實驗師，碩士，主要從事神經-體液-免疫調節機制研究。

蘇亞楠(1978-)，女，主管護師，碩士，主要從事老年癡呆研究。

R34

A

1005-9202(2017)13-3152-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.13.013

1 佳木斯大學基礎醫學院