自擬中藥復方對帶狀皰疹后遺神經痛大鼠脊髓背角iNOS表達的影響

王 麗 方玉甫 耿慶娜 周國秀 王雪峰

(河南省中醫院皮膚科 河南中醫藥大學皮膚性病研究所，河南 鄭州 450002)

自擬中藥復方對帶狀皰疹后遺神經痛大鼠脊髓背角iNOS表達的影響

王 麗 方玉甫 耿慶娜1周國秀 王雪峰2

(河南省中醫院皮膚科 河南中醫藥大學皮膚性病研究所，河南 鄭州 450002)

目的 通過建立水痘帶狀皰疹病毒慢性感染的帶狀皰疹后神經痛大鼠模型，研究自擬中藥復方對帶狀皰疹后神經痛模型大鼠脊髓背角iNOS表達的影響。方法 利用水痘帶狀皰疹病毒慢性感染大鼠，建立帶狀皰疹后神經痛動物模型。空白對照組(大鼠左趾璞注射同等劑量的生理鹽水)、模型對照組、自擬方高劑量組、自擬方低劑量組。各組大鼠分別于給藥前1 d、給藥開始后第4、7、14天檢測大鼠機械縮爪閾值、熱刺激縮爪潛伏期；末次測量完成后，取各大鼠L4 ～ L6 脊髓組織進行RT-PCR、Western印跡和免疫組化。結果 分組后給藥前1 d，模型組、自擬方高、低劑量組的MWT、PWL值明顯低于對照組，而這三組間無顯著性差異，說明造模成功。模型組MWT、PWL值第4、7、14天均比對照組明顯降低；給藥后第7、14天，自擬方高低劑量組MWT、PWL值與模型組相比均明顯升高，高劑量組在第14天MWT、PWL值與模型組相比明顯升高。模型組PWL值iNOS mRNA及蛋白表達水平與對照組相比明顯升高；自擬方高低劑量組iNOS mRNA及蛋白表達水平與模型組相比均降低，高劑量組iNOS mRNA水平與模型組相比明顯降低。結論 自擬中藥方對帶狀皰疹后神經痛模型大鼠痛覺行為有改善作用，其機制可能與下調iNOS在脊髓背角的表達有關。

帶狀皰疹后神經痛；水痘帶狀皰疹病毒；脊髓背角；誘導型一氧化氮合酶

帶狀皰疹后遺神經痛(PHN)神經病理性疼痛的發生機制目前尚在研究中，目前主要認為帶狀皰疹由病毒引起，且該病毒具有嗜神經性，人受到水痘帶狀皰疹病毒感染(VZV)后，該病毒能一直潛伏在神經節內，當人體免疫力低下或免疫功能受到抑制時就會激活該病毒，從而引起一種特征性、區域性、劇烈疼痛性的皮疹〔1～4〕，是神經損傷后周邊和中樞的敏感化帶來的灼燒痛、銳痛和異常性疼痛。目前臨床上尚缺乏行之有效的治療方案，中藥的整體調節與標本兼治的作用可減輕患者的痛苦。多項研究顯示PHN的發生與脊髓背角誘導型一氧化氮合酶(iNOS)的過表達密切相關〔5，6〕，本方中細辛等的鎮痛作用與其減少iNOS的表達有關〔7〕。本研究擬探討自擬中藥方對PHN模型大鼠脊髓背角iNOS表達的影響，探討該方的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF 級成年SD 大鼠，雄性，購自河南省醫藥科學研究院〔SYXK(豫)2013～0008〕，體重 200～220 g，共48只。動物實驗設施持續保持屏障環境標準，控制室溫為18～26℃，溫差在4℃以內；相對濕度40%～70%，晝夜各12 h；所有動物在整個飼養過程中自由飲食與活動，其余飼養條件均符合中華人民共和國國家標準GB14925-2010中的規定。

1.2 試劑與儀器 Trizol總RNA提取試劑：Invitrogen公司；組織RNA提取試劑盒：Omega公司；cDNA合成試劑盒：TaKaRa公司； PCR擴增試劑盒：Taq公司;BCA試劑盒、ECL化學發光試劑盒：Beyontime公司；iNOS 1抗：Abcam公司; BME-410A型熱痛刺激儀：中國醫學科學院生物醫學工程研究所。

1.3 動物模型復制 按照文獻〔8〕方法利用水痘帶狀皰疹病毒慢性感染大鼠，建立帶狀皰疹后神經痛動物模型。首先將CV-1細胞加入完全培養基(DMEM/F12)中制成細胞懸液，進行細胞計數后按5×104/cm2的濃度接種于培養瓶中，然后用VZV 感染CV-1細胞。約有80%的細胞被感染時(約2 d后)，收集被感染細胞于PBS中制成病毒接種細胞懸液，最后濃度約為12×106個/100 μl的病毒接種液注入SD大鼠左趾璞，每只50 μl。VZV感染后3～4 d大鼠開始出現熱痛敏閾值和機械痛敏閾值異常可判定為模型復制成功，選取成功的動物納入分組。

1.4 動物分組與給藥 除10只大鼠為空白對照組(大鼠左趾璞注射同等劑量的 生理鹽水)外，余大鼠均進行造模，造模成功的大鼠中選取30只分為模型對照組、自擬方高劑量組、自擬方低劑量組，每組10只。帶狀皰疹后遺神經痛自擬中藥方主要組成：黃芪20 g，丹參20 g，川芎12 g，元胡20 g，徐長卿20 g，川楝子15 g，細辛3 g，地龍10 g，等；以上方藥按臨床用量與動物體重關系換算為高劑量及低劑量，煎煮過濾藥渣后，藥液灌胃給藥；空白對照組及模型對照組給予等量生理鹽水。

1.5 指標檢測 各組大鼠分別于給藥前1 d、給藥開始后第4、7、14天檢測大鼠機械縮爪閾值、熱刺激縮爪潛伏期，均在每天上午相同時間進行；末次測量完成后，取各大鼠L4～L6脊髓組織進行RT-PCR、Western印跡和免疫組化。

1.5.1 機械縮爪閾值(MWT) 測定 即50%縮爪閾值。各組大鼠在相應的時間以von Frey纖維(美國 Stoelting 公司)測定機械痛閾。采用up-and-down的方法測定大鼠50%縮爪閾值。由弱到強刺激每只大鼠足底，每個刺激強度重復10次，出現5次以上縮足反射的陽性反應時，即可完成50%縮爪閾值的測定。5 MWT按50%閾值(g)=10logXf + k?/10 000進行計算，公式中Xf是指最后刺激所用力度，k是指不同刺激方式的系數，?是指各刺激力度的對數值值相鄰間距的平均數，在本實驗中?=0.186。

1.5.2 熱刺激縮爪潛伏期(PWL)測定 各組大鼠在相應的時間用BME-410A型熱痛刺激儀測定PWL值。將大鼠置于底為3 mm厚玻璃板的有機玻璃箱中，大鼠適應15 min后，用熱輻射刺激儀發出的5 mm光斑照射大鼠足底，從照射開始至大鼠出現抬腿回避時間記錄為PWL，照射時間在30 s內，因此最長記為30 s。每只大鼠同樣操作測量5次，每次間隔10 min，去掉最小值和最大值，余3次的平均值為每只大鼠的PWL值。

1.5.3 iNOS mRNA表達測定 大鼠麻醉后取L4～L6脊髓組織在潔凈操作臺上于勻漿器中加入液氮研磨后，加入Trizol進行裂解，采用RNA提取試劑盒分離提取總mRNA。總mRNA濃度測定符合要求后，采用cDNA合成試劑盒合成cDNA模板并進行逆轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)。測定iNOS mRNA的表達水平。RT-PCR 引物序列：iNOS：正義鏈：5′-CCCTTCCGAAGTTTCTGGCAGCAGC-3′，反義鏈：5′-GGGTGTCAGAGTCTTGTGCCTTTGG-3′。

1.5.4 iNOS蛋白表達測定 取 L4～L6脊髓組織于細胞裂解緩沖液中勻漿，分離提取總蛋白溶液。總蛋白濃度測定符合要求后，蛋白于SDS-PAGE膠上電泳分離轉膜。5%脫脂牛奶封閉，4℃Ⅰ抗(1∶1 000)孵育過夜，PBS洗膜3次，Ⅱ抗(1∶5 000) 孵育1 h，PBS洗膜3次，ECL化學發光試劑盒顯像。計算分析平均灰度值。

1.5.5 免疫組織化學觀察 取 L4～L6脊髓組織切片PBS后漂洗3次，iNOS 一抗(1∶200，Calbiochem，USA) 孵育過夜，PBS洗3次；二抗(1∶400)孵育6 h，PBS洗3次。經脫水、透明后石蠟包埋制片，常規染色，在顯微鏡下觀察所取組織的形態。

1.6 統計學分析 采用SPSS19.0軟件，符合正態分布的進行成組設計方差分析，組內均數差異比較用t檢驗。

2 結 果

2.1 MWT測定結果 分組后給藥前1 d，模型組、自擬方高、低劑量組的MWT值明顯低于對照組，而這三組間無顯著性差異，說明造模成功。模型組MWT值第4、7、14天均比對照組明顯降低(P<0.05)；給藥后第7、14天，自擬方高低劑量組MWT值與模型組相比均明顯升高(P<0.05，P<0.01)，高劑量組在第14天MWT值與模型組相比明顯升高(P<0.01)。見表1。

2.2 PWL測定結果 分組后給藥前1 d，模型組、自擬方高、低劑量組的PWL值明顯低于對照組，而這三組間無顯著性差異，說明造模成功。模型組PWL值第4、7、14天均比對照組明顯降低(P<0.05,P<0.01)；給藥后第7、14天，自擬方高低劑量組PWL值與模型組相比均升高(P<0.05,P<0.01)，高劑量組在第14天PWL值與模型組相比明顯升高(P<0.01)。見表2。

2.3 免疫組化結果 棕黃色顆粒沉淀為iNOS陽性表達，對照組棕黃色顆粒沉淀少見，可見對照組脊髓背角iNOS未見過度表達；模型組可見棕黃色顆粒沉淀較多密度較大，可見模型組脊髓背角iNOS過表達；而給予自擬方高、低劑量干預后，棕黃色顆粒沉淀減少，iNOS表達下降。見圖1。

表1 各組大鼠給藥前、后MWT值的變化

與模型組比較：1)P<0.05，2)P<0.01

表2 各組大鼠給藥前、后PWL值的變化

與對照組比較：1)P<0.05,2)P<0.01;與模型組比較：3)P<0.05,4)P<0.01

圖1 iNOS在各組大鼠脊髓背角中的表達(DAB，×400)

2.4 iNOS在各組大鼠脊髓背角中的表達 模型組iNOS mRNA及蛋白表達水平與對照組相比明顯升高(P<0.05)；自擬方高低劑量組iNOS mRNA及蛋白表達水平與模型組相比均降低(P<0.05,P<0.01)，高劑量組iNOS mRNA表達水平與模型組相比明顯降低(P<0.01)。見表3，圖2、圖3。

表3 自擬方對VZV大鼠脊髓背角iNOS mRNA及蛋白表達的影響

與模型組比較：1)P<0.05，2)P<0.01

圖2 自擬方對VZV大鼠脊髓背角iNOS mRNA表達的影響

圖3 自擬方對VZV大鼠脊髓背角iNOS 蛋白表達的影響

3 討 論

帶狀皰疹常因延誤治療而帶來嚴重的并發癥，即使發現后給予及時的抗病毒治療，PHN的發生率仍然較高。人體初次感染水痘-帶狀皰疹病毒，雖然通常發生在童年時期，但VZV 具有嗜神經性，容易沿著軸突逆行轉運并靜息、潛伏于感覺神經節。老年人容易發生免疫功能生理性減退或由于腫瘤、自身免疫性疾病、感染、器官移植排斥反應等使得免疫系統受抑制時，VZV可能被重新激活，大量復制后沿軸突轉運到人體表層即皮膚，而產生皰疹，產生神經性急性疼痛。目前治療急、慢性疼痛藥物常用的有阿片肽類藥物、辣椒素受體抑制劑、抗抑郁藥、局麻藥和類固醇類等，但對 PHN 的療效不佳；對于大部分老年人患者，自身免疫功能降低，且常有心腦血管功能、呼吸系統功能、內分泌功能等異常性疾病合并發生，大劑量的上述藥物可能帶來更嚴重的藥物副作用而給生命帶來危害。合適的動物模型是研究PHN發生發展機制以及藥物作用機制的重要橋梁。Guedon等〔9〕成功建立了 VZV 慢性感染的PHN動物模型。研究者將感染 VZV 的 CV-1 細胞經過皮下注射于大鼠左趾蹼，3～4 d后成功感染的大鼠會開始出現痛覺異常，2 w左右痛覺閾值達到最低值，該效應至少持續7～8 w，14 w左右可恢復到基線水平，這些表現與臨床上患者 PHN 的發生、發展與消退過程十分相似。因此，該模型成為目前運用最多的并被大多數研究者認為是用于研究PHN 相對可靠的模型。本研究發現造模后，模型組的痛覺行為MWT、PWL值均明顯降低，且在14 d差異更加顯著。提示VZV感染后疼痛模型復制成功。

免疫力低下、周圍神經纖維以及末梢發生炎癥和變性，是目前認為PHN發病的主要原因，而脊髓等中樞神經系統與其發生也有密切關系〔10〕。有學者發現 PHN 病人的脊髓背角、前扣帶回皮質等參與痛覺信息調控的中樞中，相關的核團或腦區呈現出過度代謝和激活狀態〔11〕。脊髓背角可能起著至為關鍵的作用。研究發現其上的iNOS過表達可能參與PHN的發生與進程〔4〕。一氧化氮(NO) 作為重要的神經遞質，參與中樞及外周不同程度的痛覺調制，在脊髓更顯示出起著極其重要的作用〔12〕。外周神經損傷可見脊髓背角NOS 的過度表達；而給予全身或鞘內注射NOS 抑制劑則可對神經病理性痛起到良好的鎮痛作用，有研究結果顯示NOS三個亞型中只有 iNOS 參與了PHN 的形成和維持。在本研究中，模型組大鼠脊髓背角iNOS mRNA及蛋白均處于表達狀態，顯示出iNOS與VZV誘導的PHN模型密切相關。而給予自擬中藥方干預后大鼠脊髓背角iNOS mRNA及蛋白表達水平均下降，而痛覺行為MWT、PWL值也升高，且以高劑量較為顯著。自擬方以黃芪、丹參等調解免疫系統，以川芎、元胡、細辛、徐長卿、川楝子等緩解疼痛，川芎〔13〕、細辛〔7〕、元胡〔14〕等均有研究報道能通過下調神經或組織iNOS表達水平而起到鎮痛作用，結合本研究結果，推測本研究中的中藥復方臨床用于治療PHN的機制可能通過下調iNOS信號通路實現。

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〔2016-10-15修回〕

(編輯 徐 杰)

河南省教育廳科學技術研究重點項目資助計劃(14A320056)；河南省中醫藥科學研究專項課題(2013ZY04036)

王 麗(1982-)，女，碩士，主治醫師，主要從事中西醫結合治療皮膚病、性病方面研究。

R752.1+2

A

1005-9202(2017)13-3145-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.13.010

1 開封市第二人民醫院皮膚科 2 河南省中醫院康復科