阿米替林對腸易激綜合征大鼠結腸和下丘腦促腎上腺皮質激素釋放因子表達的影響

趙廷坤 劉兆霞 曲梅花

(濰坊醫學院應用藥理學山東省重點實驗室 濰坊醫學院藥理學教研室，山東 濰坊 261053)

阿米替林對腸易激綜合征大鼠結腸和下丘腦促腎上腺皮質激素釋放因子表達的影響

趙廷坤 劉兆霞 曲梅花

(濰坊醫學院應用藥理學山東省重點實驗室 濰坊醫學院藥理學教研室，山東 濰坊 261053)

目的 探討阿米替林對腸易激綜合征(IBS)大鼠結腸和下丘腦促腎上腺皮質激素釋放因子(CRF)表達的影響。方法 將30只成年Wistar大鼠隨機分為3 組：正常對照組、 IBS模型組、阿米替林組。采用體重、排便粒數、敞箱實驗評分和糖水偏嗜度，評價阿米替林對IBS的作用，采用RT-PCR和Western印跡檢測大鼠結腸和下丘腦中CRF表達水平的變化。結果 IBS模型大鼠體重下降、排便增加、運動減少和興趣缺失，同時下丘腦和結腸CRF的表達均顯著高于正常對照組(P<0.05)，阿米替林預防應用可改善IBS模型大鼠的癥狀，同時可減少IBS模型大鼠下丘腦和結腸CRF的表達(P<0.05)。結論 預防應用阿米替林可改善IBS大鼠的癥狀，其機制可能與結腸和下丘腦CRF的表達下降有關。

阿米替林；促腎上腺皮質激素釋放因子；腸易激綜合征

腸易激綜合征(IBS)發病機制尚未完全明確。研究認為精神心理因素在IBS的發病中起重要作用，應激、焦慮和抑郁與IBS密切相關，抗抑郁藥可改善患者的腸道及精神心理癥狀〔1〕。促腎上腺皮質激素釋放因子(CRF)是一種重要的神經內分泌肽，精神心理因素能夠改變CRF家族參與的信號通路，促使功能性腸道疾病的發生〔2〕，大腦和腸道中的CRF家族因子是急性或慢性刺激中的重要調節因子。阿米替林是臨床最常用的三環類抗抑郁藥，可改善IBS患者精神神經功能〔3〕，本研究以急慢性聯合應激制作IBS模型大鼠，并用阿米替林進行干預，通過RT-PCR和Western印跡檢測CRF在下丘腦和結腸的表達，探討其表達變化與IBS發病的關系，為抗抑郁藥阿米替林治療IBS的作用機制提供新證據。

1 資料與方法

1.1 實驗試劑和儀器 熒光定量RT-PCR試劑盒，總RNA提取試劑盒，cDNA逆轉錄合成試劑盒，DEPC，EDTA均由生工生物工程(上海)股份有限公司提供。引物由寶生物工程(大連)有限公司合成。兔抗大鼠CRF多克隆抗體、兔抗大鼠β-actin多克隆抗體、辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗兔IgG、化學發光試劑盒均由北京博奧森生物技術有限公司提供。美國PE公司5700型定量基因分析儀，美國ProteinSimple公司AlphaImager EP數字成像分析系統。

1.2 實驗動物和分組 雄性Wistar大鼠，4～6周齡，SPF級，體重180～200 g，由山東魯抗醫藥股份有限公司實驗動物室提供，許可證號：SCXK魯2008 0002。實驗動物30只隨機分為 3 組：對照組、模型組、阿米替林組，模型組采用急慢性聯合應激制備模型，參照文獻〔4〕施加以慢性不可預見性的刺激21 d，第28天給予急性束縛應激〔5〕；正常對照組大鼠單籠常規飼養，不給予任何刺激，模型組和阿米替林組大鼠單只孤養，阿米替林組從施加刺激起每天給予腹腔注射10 mg/kg阿米替林(劑量參考文獻〔6〕)。

1.3 腸道敏感性評估 ①體重測定：在造模前和造模后分別測定大鼠體重。②排便測定：測定造模前和造模后各組大鼠在2 h內的排便顆粒數。③敞箱實驗〔7〕：所用敞箱高40 cm，長寬均為80 cm，各壁均為黑色，用白線劃分底面為面積相等的25 塊。實驗在明暗合適、安靜的房間中進行。將單只大鼠置于敞箱中央，測定其5 min內穿越地面方塊數作為水平運動得分，以站立次數為垂直運動得分。水平穿越1 格為1分，垂直站立1次為1分，兩者相加為敞箱實驗評分。④糖水消耗實驗〔4〕：將試驗分為訓練期和測試期。實驗前72 h，訓練各組大鼠適應含糖飲水，先給予大鼠兩瓶重量一致 1%蔗糖水24 h，然后給予1瓶1%蔗糖水和1瓶純水飲用24 h，兩瓶重量一致。適應完成后，禁水禁食 24 h，在安靜通風、明暗合適的環境中進行測試：同時給予每只大鼠1瓶200 ml 1%蔗糖水和1瓶200 ml純水，24 h后測量各自的消耗量，按下式計算：蔗糖水偏嗜度=糖水消耗量/(糖水消耗量+純水消耗量)×100%。比較造模前后蔗糖水偏嗜度的變化。

1.4 定量RT-PCR檢測CRF基因表達 對大鼠予水合氯醛腹腔注射麻醉、斷頭處死，取大腦組織，在冰上剝離出下丘腦，組織稱重后，置于液氮保存；剖腹手術分離遠端結腸，取距肛門約4 cm處結腸1 cm，置于液氮內，再轉至-80℃冰箱保存。按照試劑盒說明提取下丘腦和結腸總RNA，并逆轉錄出cDNA。從Gene Bank中查出大鼠甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)、CRF mRNA 序列，設計引物如下：GAPDH 上游引物：5′-GGCACAGTCAAGGCTGAGAATG-3′；下游引物：5′-ATGGTGGTGAAGACGCCAGTA3′；擴增產物143 bp；CRF上游引物：5′-TGGATCTCACCTTCCACCTTCTG-3′，下游引物：5′-CCGATAATCTCCATCAGTTTCCTG-3′；擴增產物101 bp。取2 μl cDNA為模板進行PCR擴增，加入擴增反應體系中，設三個復孔，PCR反應體系(25 μl)如下：12.5 μl MIX，6.5 μl ddH2O，上下游 引物各2 μl，2 μl cDNA模板。GAPDH和CRF反應條件：50 ℃ 2 min，預變性95 ℃ 5 min，變性94 ℃ 5 s，退火：GAPDH，59 ℃，CRF，57℃，30 s，延伸72 ℃ 30 s，共40個循環，終末延伸72 ℃ 7 min。PCR產物用2 %瓊脂糖凝膠電泳，應用凝膠成像分析系統掃描分析，通過Quantity One軟件分析光密度值。CRF的條帶密度與內參GAPDH條帶密度的比值，作為CRF基因mRNA表達的相對水平。

1.5 Western印跡檢測CRF蛋白表達 將下丘腦和結腸，分別加入細胞蛋白裂解液提取蛋白，Bradford方法測定蛋白濃度，配置8%的SDS-PAGE凝膠，將總蛋白加樣，恒壓電泳，恒流轉膜，加入5%的脫脂奶粉封閉過夜，加一抗兔抗大鼠CRF多克隆抗體，孵育2 h，PBS洗滌2次，加辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG，孵育2 h，ECL顯色，暗室曝光，凝膠圖像用Quantity One軟件分析。

1.6 統計學方法 采用SPSS13.0統計軟件進行F及t檢驗。

2 結 果

2.1 腸道敏感性評估 造模前各組大鼠體重、糞粒數、敞箱實驗評分和蔗糖偏嗜度無差異，給予急慢聯合應激刺激后，模型組大鼠體重和敞箱實驗評分均顯著低于對照組(P<0.05)，模型組大鼠排便數量明顯多于對照組(P<0.05)，同時模型組大鼠興趣缺失，糖水偏嗜度降低(P<0.05)；給予阿米替林干預，可增加大鼠體重和敞箱實驗評分，均高于模型組(P<0.05)，使大鼠排便數減少，改善模型組大鼠興趣缺失，提高糖水偏嗜度(P<0.05)，見表1。

表1 各組腸道敏感性比較

與對照組比較：1)P<0.05；與模型組比較：2)P<0.05

圖1 下丘腦和結腸組織中CRF和GAPDH的RT-PCR結果

2.2 結腸和下丘腦CRF mRNA的檢測 CRF和GAPDH的擴增曲線成單峰，表明擴增的PCR產物單一，無特異性擴增產物。如圖1顯示CRF和GAPDH片段擴增情況，CRF片段為101 bp，GAPDH片段為143 bp，CRF和GAPDH擴增片段退火曲線結果顯示PCR產物為預期設計的特異片段。CRF mRNA表達以GAPDH為內參對照，RT-PCR結果顯示，與對照組(結腸：0.39±0.04，下丘腦：0.34±0.02)比較，模型組大鼠結腸(1.07±0.12)和下丘腦(1.32±0.11)中CRF的表達量均有升高(P<0.01)；阿米替林組大鼠結腸(0.74±0.07)和下丘腦(0.70±0.05)中CRF的表達量均低于IBS模型組大鼠(P<0.05)，但其高于對照組大鼠(P<0.05)。見圖2。

圖2 各組結腸和下丘腦組織中CRF mRNA的表達

2.3 結腸和下丘腦CRF蛋白的表達 CRF蛋白表達變化以β-actin為內參對照，Western印跡結果顯示，與對照組(結腸：0.40±0.02；下丘腦：0.49±0.03)比較，模型組大鼠結腸(1.21±0.13)和下丘腦(1.12±0.11)中CRF蛋白的表達量均有升高(P<0.01)；阿米替林組大鼠結腸(0.59±0.04)和下丘腦(0.81±0.08)中CRF蛋白的表達量均低于模型組大鼠(P<0.05)，但其高于對照組大鼠(P<0.05)。見圖3。

圖3 各組結腸和下丘腦組織中CRF 蛋白表達

3 討 論

IBS病因復雜，是生理-心理-社會綜合病征的代表之一，其發病機制可能與胃腸功能異常、內臟感覺高敏感性以及腦-腸軸異常等因素相關〔5〕。應激能夠引起IBS內臟高敏性的形成，引起或者加重IBS癥狀。本課題組前期給予Wistar大鼠急慢性聯合應激，可成功建立IBS大鼠模型〔8〕，本研究采用此方法建立IBS模型。

CRF主要由下丘腦分泌，其功能是使機體適應應激刺激，調節內臟活動和情緒反應。中樞和腸道中CRF是急慢性刺激中的重要調節因子，其在應激與腸道疾病的相關性中起到重要作用。大鼠下丘腦的室旁核和藍斑注射CRF，可顯著促進結腸運動，使結腸的通過時間要縮短，糞便排出量可增加20倍〔9〕。在大鼠中樞注射CRF可以加劇結腸擴張誘導的內臟痛。外周靜脈注射或腹腔注射 CRF 可刺激大鼠結腸傳輸和排便，引起水樣腹瀉。臨床研究表明，人體外周注射CRF可以降低結腸擴張的痛閾及增加結腸運動，IBS患者腦-腸軸對 CRF 反應更加敏感〔10〕。本實驗表明，給予急慢性聯合應激建立的IBS模型大鼠體重下降、排便增加、運動減少和興趣缺失，同時下丘腦和結腸CRF的表達均顯著高于正常對照組，說明急慢性聯合應激建立的IBS模型與下丘腦和結腸CRF的高表達有關。

IBS患者多數伴有心理精神障礙，抗抑郁藥能明顯減輕某些腹瀉型IBS患者腹部不適的癥狀。阿米替林屬于最經典且應用最廣泛三環類抗抑郁藥，在中樞，通過抑制邊緣系統的異常激活，改善IBS患者腹痛癥狀〔3〕；在外周，阿米替林可通過抑制胃腸運動，縮短胃腸通過時間，改善患者的排便狀況〔11〕，此外，阿米替林可改善IBS患者的焦慮抑郁癥狀，有助于減輕患者消化道癥狀。本實驗結果表明，阿米替林預防應用可改善IBS模型大鼠的癥狀，增加體重，減少排便，恢復其運動和興趣，同時可減少IBS模型大鼠下丘腦和結腸CRF的表達，說明阿米替林改善IBS模型大鼠的癥狀與下丘腦和結腸CRF的表達減少相關。以上提示阿米替林對IBS模型大鼠內臟高敏感的治療作用，可能是通過降低腸道和中樞CRF的表達而產生，其作用機制可能與阿米替林對腦-腸軸的調節有關。

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8 劉兆霞，季萬勝，劉曉麗，等.Ucn3及其受體CRFR2在腸易激綜合征大鼠模型腸神經系統中的表達〔J〕.世界華人消化雜志，2012；20(13)：1094-9.

9 Taché Y，Martinez V，Million M，etal.Stress and the gastrointestinal tract.Ⅲ.Stress-related alterations of gut motor function：role of brain corticotropin-releasing factor receptors〔J〕.Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol，2001；280(2)：G173.

10 Martinez V，Wang L，Rivier JE，etal.Differential actions of peripheral corticotropinreleasing factor (CRF)，urocortin Ⅱ，and urocortin Ⅲ on gastric emptying and colonic transit in mice：role of CRF receptor subtypes 1 and 2〔J〕.J Pharmacol Exp Ther，2002；301(2)：611-7.

11 Vahedi H，Merat S，Momtahen S，etal.Clinical trial：the effect of amitriptyline in patients with diarrhoea-predominant irritable bowel syndrome〔J〕.Aliment Pharmacol Ther，2008；27(8)：678-84.

〔2016-01-19修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢園)

山東省高等學校科技計劃項目(No.J11LF33)

趙廷坤(1981-)，男，講師，碩士，主要從事神經內分泌學研究。

R574.4

A

1005-9202(2017)13-3142-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.13.009