枸杞多糖在白血病患者中的應用及對HL-60和NK細胞殺傷活性的影響

肖 芳 吳 琦

(廣州中醫藥大學，廣東 廣州 510000)

枸杞多糖在白血病患者中的應用及對HL-60和NK細胞殺傷活性的影響

肖 芳 吳 琦1

(廣州中醫藥大學，廣東 廣州 510000)

目的 探討枸杞多糖在白血病患者中的應用及對人前髓細胞HL-60表面靶細胞表面相應配體(MICA)蛋白表達水平和自然殺傷(NK)細胞殺傷活性的影響及機制。方法 取白血病患者HL-60細胞，隨機分為觀察1組、觀察2組及觀察3組，分別放入濃度為6、8、10 mg/ml枸杞多糖共同培養，未經枸杞多糖作用的30例白血病患者HL-60細胞為對照組，采用流式細胞儀測定4組細胞表面MICA蛋白表達水平。將4組獲得的溶液與NK細胞相互混合，20 h后采用四甲基偶氮唑藍比色(MTT)法檢測NK細胞對4組HL-60細胞的殺傷活性進行測定。結果 觀察1組MICA表達率顯著低于觀察2組、觀察3組(P<0.05)；觀察1組、觀察2組、觀察3組MICA表達率高于對照組(P<0.05)；隨著靶細胞、效應細胞比的不斷增加，4組NK細胞殺傷活性均出現上升趨勢；觀察1組、觀察2組及觀察3組NK細胞殺傷活性高于對照組(P<0.05)；觀察3組NK細胞殺傷活性，高于觀察1組、觀察2組(P<0.05)。結論 白血病患者體內HL-60細胞在枸杞多糖的孵育下能提高細胞MICA表達率，且呈濃度正相關性。同時，枸杞多糖能提高機體內NK細胞的殺傷活性，能清除微小病灶。

枸杞多糖；白血病；HL-60細胞；MICA表達率；自然殺傷細胞；殺傷活性

自然殺傷(NK)細胞屬于人體的免疫細胞，是機體的第一道防御屏障，在抑制腫瘤的生長、增殖中發揮重要的作用，其殺傷活性與細胞表面受體、靶細胞表面配體關系密切〔1〕。白血病屬于血液性腫瘤，死亡率、復發率較高〔2〕。目前，臨床上對于白血病以化療、異基因造血干細胞抑制治療為主。隨著醫療技術的不斷發展，以NK細胞活化受體與配體(MICA-NKG2D)靶向治療在白血病患者中得到應用，該方法采用MICA抗體封閉的白血病細胞株能提高NK細胞殺傷作用，治療效果更加敏感。白血病患者與NK細胞敏感性關系表明〔3〕，MICA對腫瘤具有生長抑制作用，能激發NK細胞和T細胞免疫。但是，人體中NK細胞數量相對較少，在外周淋巴細胞中僅占5%～15%。枸杞中含有植物多糖、蛋白質等營養成分，能發揮“補益精氣”等功效。文獻報道，枸杞多糖中含有多種耐藥逆轉活性物質，通過調節機體免疫能殺死腫瘤細胞，提高機體免疫和細胞殺傷活性，但是該結論尚未得到進一步證實。本文旨在探討枸杞多糖在白血病患者中的應用及對人急性早幼粒白血病細胞(HL-60)表面MICA蛋白表達水平和NK細胞殺傷活性的影響及機制。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 于2014年1月至2016年6月取90例白血病患者HL-60細胞，隨機分為觀察1組、觀察2組及觀察3組，每組30例。其中男54例，女36例，年齡15～74〔平均(32.6±2.5)〕歲。未經枸杞多糖作用的30例白血病患者HL-60細胞為對照組。其中男18例，女12例，年齡16～75〔平均(33.1±2.7)〕歲，納入標準：①符合白血病臨床診斷標準；②經生化指標檢驗，病理學測定確診。排除標準：①合并有影響效應指標觀測、判斷其他生理或病理者；②合并嚴重心、肝、腎功能異常者；③合并傳染性疾病及意識不清或存在精神障礙者。

1.2 儀器及試劑 RPMI-1640粉劑(美國Gibco公司)；枸杞多糖(純度98%)(寧夏紫金花藥業股份有限公司)；FITC標記的山羊抗小鼠IgG(美國eBioscience公司)；CO2細胞培養箱(日本SANYO牌)；低速離心機(北京醫用離心機廠)；Olympus倒置顯微鏡(OlympuS公司)；FACSCalibur流式細胞儀(Becton Dickinson公司)；WellscanMK3酶標儀(Labsystems Dragon公司)。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養 ①HL-60培養。將分離獲得的HL-60放置在濃度為10.0%胎牛血清的RPMI1640培養基中，37℃、5%CO2孵箱內培養，觀察培養瓶中培養基顏色的變化，每3 d換液1次，600 r/min離心5 min，去除上層清液采用吸管吹打混合均勻后添加完全培養液，繼續在37℃、5%CO2孵箱內培養。采集細胞，600 r/min離心5 min，去除上層清液。調整細胞濃度1×106/ml，分別加入濃度為6、8、10 mg/ml枸杞多糖共同培養，37℃、5%CO2孵箱內培養，設立對照孔。48 h后收集細胞，1 200 r/min離心10 min，用于測定各組MICA表達率。②NK細胞培養。將獲得的NK細胞接種在濃度為10.0%胎牛血清的RPMI1640培養基中，37℃、5%CO2孵箱內培養，觀察培養瓶中培養基顏色的變化，每4～5 d換液1次，800 r/min離心10 min，去除上層清液，采用尖吸管吹打混合后加入完全培養液，37℃、5%CO2孵箱內進行培養。③混合培養。將HL-60作為靶細胞，加入濃度為10.0%胎牛血清的RPMI1640培養基，調整細胞濃度1×104/ml接種在96孔板中，每孔50 μl，以NK作為效應細胞，根據靶細胞、效應細胞比5∶1、10∶1、20∶1調整細胞濃度，混合后放入37℃、5%CO2孵箱內進行培養，設置單細胞靶孔為對照組〔5〕。

1.3.2 HL-60表面MICA表達及NK細胞殺傷活性測定 (1)MICA表達。采集3種經枸杞多糖作用后的HL-6，放入離心管中，1 200 r/min離心10 min，去除上層清液，采用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次，調整細胞濃度為1×107/ml，分管后每管加入1×106/0.1 ml細胞懸液，并加入MICA單抗，4℃下進行30 min標記，加入PBS洗滌液，1 500 r/min離心5 min，加入100 μl FITC標記的山羊抗鼠IgG，4℃下進行30 min標記，加入PBS洗滌液洗滌2次，然后上流式細胞儀檢測，以對照管作為空白定標，分析4組細胞中陽性細胞表達率〔6〕。(2)NK細胞殺傷活性測定。取枸杞多糖處理后的HL-60和NK細胞混合溶液，培養20 h后向每孔中加入10 μl噻唑藍(MTT)溶液，37℃、5%CO2孵箱內進行24 h培養，使得沉淀充分溶解，采用WellscanMK3酶標儀測定波長在570 nm下各孔的吸光度值〔9〕。細胞殺傷活性=〔1-(Ae+t-Ae)/At〕×100.0%。Ae+t：殺傷孔OD值；Ae為單純效應細胞OD值；At單純靶細胞OD值。

1.4 統計學方法 應用SPSS18.0軟件進行χ2、t檢驗。

2 結 果

2.1 4組HL-60 MICA表達水平比較 觀察1組MICA表達率〔(65.02±2.24)%〕顯著低于觀察2組〔(42.29±1.57)%〕、觀察3組〔(10.34±0.91)%〕(P<0.05)；觀察1組、觀察2組、觀察3組MICA表達率顯著高于對照組〔(6.34±0.81)%〕(P<0.05)。

表1 4組NK細胞殺傷活性比較

與對照組比較：1)P<0.05；與觀察3組比較：2)P<0.05

2.2 4組NK細胞殺傷活性比較 見表1。隨著靶細胞、效應細胞比的不斷增加，4組NK細胞殺傷活性均出現上升趨勢；觀察1組、觀察2組及觀察3組NK細胞殺傷活性顯著高于對照組(P<0.05)；觀察3組NK細胞殺傷活性顯著高于觀察1組、觀察2組(P<0.05)。

3 討 論

目前，臨床上對于白血病多以大劑量聯合化療為主，該方法雖然能改善患者癥狀，但是長期療效欠佳，僅有不到40.0%患者能獲得長期生存，且患者5年生存率較低〔8〕。隨著醫療技術的不斷發展，免疫治療在白血病患者中得到應用，該方法無論在原發性白血病還是復發性白血病患者中均能獲得較高的緩解率。免疫治療主要通過增強或抑制免疫功能對機體進行有效的改善，從而能提高機體免疫干預，達到治療的目的。同時，免疫治療能有效清除殘余的惡性腫瘤，提高腫塊抗原免疫原性，從而提高機體細胞免疫應答。體外研究顯示〔9〕，NK細胞對多種腫瘤具有細胞毒活性，能有效改善患者癥狀，延長患者壽命。但是人體中NK細胞數量相對較少，治療時長期療效欠佳，臨床需要采取有效的措施提高NK細胞數量。

為了進一步提高NK細胞的殺傷活性，必須要降低抑制信號水平，提高激活信號水平，從而對沖抑制性信號，形成刺激性信號的強勢，最終殺滅腫瘤細胞。文獻報道〔10〕，通過藥物干預能有效提高腫瘤細胞表面mMICA表達水平，進一步激活NK細胞對腫瘤的細胞殺傷活性，而sMICA對于機體抗腫瘤能發揮其負調節作用，是否存在藥物進行有效的干預尚需要進一步研究和探討。組蛋白取乙酰化抑制劑丙戊酸鈉能有效提高肝癌表面的MICA水平，從而能有效提高NK細胞殺傷活性。患者用藥后機體內的曲骨霉素A、維生素D3等均會隨著白血病細胞的上NKG2D配體表達。部分靶分子藥物能有效地提高腫瘤細胞的表達能力，直接作用在腫瘤細胞的內外源性凋亡途徑的多個靶點，從而能上調NK細胞活化受體的配體，能有效地提高腫瘤細胞對NK細胞的殺傷敏感性。本研究結果提示枸杞多糖在白血病患者中能發揮重要的作用。

目前，枸杞多糖是臨床上常用的治療藥物，該藥物具有增強免疫功能和抗腫瘤等效應，藥物能從降低抑制性信號水平、提高激活性信號水平，形成刺激性信號的強勢，從而殺死腫瘤細胞。國外學者研究顯示，枸杞多糖具有良好的抗腫瘤和調節機體免疫等藥理作用〔4〕。本研究結果提示機體中MICA表達的提高能進一步提高白血病細胞對于患者NK細胞的介導作用，能有效提高細胞殺傷能力，即MICA水平的高低決定了白血病患者治療效果及預后情況，通過采用枸杞多糖能有效提高患者MICA水平，從而能提高NK細胞殺傷活性，改善患者預后，促進患者早期恢復，降低治療后復發率。因此，臨床上對于白血病的治療可以在患者身體狀況允許下適當采用枸杞多糖，提高機體免疫，從而能有效改善患者癥狀，通過機體免疫殺死腫瘤，從而改善患者生存質量，使得患者的治療更具針對性〔11〕。

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9 朱 雨，錢思軒，李建勇，等.《地西他濱治療老年初診急性髓系白血病的多中心、開放性、Ⅲ期臨床試驗(注冊試驗DACO-016)》解讀〔J〕.中華血液學雜志，2013;34(1):83-5.

10 常 城，楊 波，張 琳，等.地西他濱聯合自體CIK細胞治療2例高齡急性髓系白血病的療效觀察〔J〕.中國實驗血液學雜志，2013;21(1):62-7.

11 馬樹沛，林 梅.地西他濱聯合小劑量阿糖胞苷治療老年急性髓系白血病臨床觀察〔J〕.中國老年保健醫學，2015;29(3):6-8，13.

〔2017-03-22修回〕

(編輯 袁左鳴/滕欣航)

廣東省自然科學基金項目(No.10451008901001139)

肖 芳(1980-)，女，在讀博士，主治醫師，主要從事中醫內科血液病學研究。

R733.7

A

1005-9202(2017)13-3140-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.13.008

1 廣東醫科大學