老年性聾小鼠認知功能的下降及其機制

方儀德 何祖燕 陳 丹 陳圣敏 楚 敏 隋 璐 董 楊

(上海中醫藥大學教學實驗中心，上海 201203)

老年性聾小鼠認知功能的下降及其機制

方儀德 何祖燕 陳 丹 陳圣敏 楚 敏 隋 璐 董 楊

(上海中醫藥大學教學實驗中心，上海 201203)

目的 觀察C57BL/6J老年性聾小鼠認知功能的改變并探討其機制。方法 雄性C57BL/6J小鼠分為3月齡(青年)組和12月齡(中年)組。聽性腦干反應(ABR)檢測小鼠聽功能，Morris水迷宮觀察小鼠的空間學習和記憶能力，Western印跡檢測小鼠海馬和聽皮層BDNF和p-TrkB的蛋白表達。結果 12月齡小鼠8、16、24 kHz和32 kHz的聽閾值與3月齡組比較明顯上升(P<0.01)，提示聽功能嚴重損失。Morris水迷宮實驗結果顯示，從訓練的第3天開始直到第5天，12月齡組小鼠潛伏期均顯著高于3月齡組(P<0.01,P<0.05)，12月齡組小鼠穿越平臺次數顯著低于3月齡組(P<0.01)。Western印跡結果發現，與3月齡小鼠比較，12月齡小鼠海馬和聽皮層BDNF蛋白表達無明顯變化，p-TrkB蛋白表達降低。結論 12月齡C57BL/6J小鼠即顯示明顯的認知功能下降，可能與其早發的老年性聾有一定關系，海馬和聽皮層TrkB蛋白的磷酸化可能是主要機制之一。

老年性聾;認知功能;海馬;聽皮層

大量臨床觀察表明，聽力損失的患者更容易發展成為阿爾茨海默病(AD)或者其他類型的老年癡呆。有研究報道，癡呆者比非癡呆者的聽力障礙更多見，二者不僅相關，聽力下降程度與認知障礙程度之間還存在著明顯的正相關，即聽力障礙越重，認知障礙越重，使用助聽器能夠使認知功能障礙改善〔1,2〕。Gates等〔3〕在進行了大規模的臨床前瞻隊列研究后指出，中樞聽覺言語處理障礙中47%發展為AD失智型，而對照組中只4.6%，認為聽力障礙可能是AD的早期癥狀。有學者在老年性聾模型C57BL/6J小鼠觀察到年齡相關的聽力損失伴隨空間學習記憶能力的下降以及海馬CA3區突觸的退化，而無老年性聾的小鼠模型CBA/CaJ則無此特征〔4〕。雖然老年性聾與認知功能障礙或老年癡呆等疾病相關的機制尚不清楚，但二者的關聯已經被大量臨床研究證明確實存在，聽力障礙可以作為預測隨訪期間認知功能是否下降的指標，而對老年人聽力損失進行早期干預有可能延緩老年癡呆的發生〔5,6〕。因此，探討老年性聾與認知功能下降的關系及其機制有一定的臨床指導意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 雄性C57BL/6J小鼠由上海斯萊克實驗動物有限公司提供，許可證號：SCXK(滬)2012-0002。

1.1.2 實驗儀器 TDT-Ⅲ系統：美國Tucker-Davis-technologies公司； Ethovision XT動物軌跡跟蹤及行為觀察記錄分析系統：荷蘭Noldus information technology公司；水平、垂直電泳及轉膜裝置：美國Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 聽性腦干反應(ABR) 記錄電極置于小鼠的顱頂，參考電極置于刺激側耳廓，地線接對側耳廓。采用TDT-Ⅲ系統測試，刺激聲為8,16,24，32 kHz的短純音，聲刺激從90 dB開始，5 dB遞減，以能分辨出ABR波形的刺激強度確定閾值。

1.2.2 Morris水迷宮 Morris水迷宮實驗分為定位航行和空間探索兩部分。將水迷宮均分為4個象限，實驗訓練階段為5 d。每只小鼠每天接受2次訓練，每次60 s，兩次訓練間隔為30 s。如果小鼠在60 s內上臺，則允許其在平臺停留30 s。如果小鼠在60 s內不能找到平臺，則將其引導至平臺并使其停留30 s，其潛伏期即為60 s(定位航行實驗)。實驗第6天撤除平臺，分2次將小鼠放入水中，游泳時間60 s，記錄并分析小鼠穿越原平臺位置的次數(空間探索實驗)。

1.2.3 Western印跡 組織按照每20 mg/100 μl的比例加入裂解液，充分裂解后，離心，取上清。BCA法測蛋白濃度。樣品按40 μg樣品蛋白/孔上樣，12% SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，濕轉75 min(4℃，100 V)，5%脫脂奶粉室溫平搖封閉2 h，然后分別用GAPDH(1∶2 000)、BDNF(1∶200)和p-TrkB(1∶500)一抗4℃平搖過夜，HRP標記二抗(1∶2 000)避光孵育2 h，采用ECL Plus顯色液顯色。

1.3 統計學分析 采用PrismDemo5.0軟件進行t檢驗。

2 結 果

2.1 聽功能損傷 采用ABR檢測聽功能，見圖1。實驗結果表明，12月齡小鼠8 kHz、16 kHz、24 kHz和32 kHz 的聽閾值與3月齡組比較均有明顯升高(P<0.01)，提示12月齡中年小鼠已經產生嚴重的聽功能損失。

與3月齡比較：1)P<0.01圖1 ABR檢測聽功能

2.2 空間和學習記憶能力下降 實驗過程包括5 d的定位航行訓練和1 d的空間探索實驗，小鼠游泳軌跡見圖2A。定位航行實驗結果表明，從訓練的第3天開始，3月齡小鼠的潛伏期即有顯著的下降，而12月齡小鼠在5 d的訓練過程中潛伏期沒有明顯變化。第3～5天，12月齡小鼠的潛伏期明顯高于3月齡小鼠(P<0.01,P<0.05)，見圖2B。經過5 d的訓練后撤掉平臺，進行空間探索實驗。結果顯示，12月齡組小鼠穿越平臺次數(0.1±0.2)明顯低于3月齡組(0.8±0.2，P<0.01)。見圖2。

與3月齡組比較：1) P<0.01,2) P<0.05；(A)游泳軌跡圖；(B)潛伏期圖2 Morris水迷宮實驗

2.3 蛋白表達變化 12月齡組小鼠海馬和聽皮層p-TrkB蛋白表達均低于3月齡組，提示與3月齡小鼠比較，12月齡小鼠TrkB蛋白磷酸化水平降低。兩組小鼠海馬和聽皮層BDNF表達均無明顯差異。見圖3。

圖3 Western印跡檢測蛋白表達

3 討 論

本研究發現老年性聾模型小鼠C57BL/6J在12月齡中年期即發生了明顯的認知功能下降，這可能與其早發的聽力損失有關。有報道，無早發型老年性聾的CBA/CaJ小鼠，在18個月仍能保持較好的學習和記憶功能，從另一個方面證明了認知功能的下降與聽力損失可能存在某種聯系〔7〕。而對于聽功能是如何影響認知功能的，目前尚不十分清楚。有研究表明，對于聽功能喪失的補償可能引起與癡呆相關的神經血管和神經生理學改變，進而引起認知功能的下降〔8〕。還有學者認為，老年性聾可以引起皮層改變，進而影響與老年癡呆相關的腦區發生病理改變〔6,9〕。

聽皮層是聽覺通路的高級中樞，聽皮層的功能異常和病理改變是老年性聾的重要發病機制之一〔10,11〕。海馬是反映認知功能的主要腦區，與學習記憶能力密切相關。神經解剖學研究發現，聽覺信息到達海馬的通路主要有兩條：丘腦投射系統從耳蝸神經核團經過內膝體到上橄欖核、中腦隔核、聽皮層，這條通路經皮層聯合區域進入內嗅區，到達海馬；由耳蝸神經核經非丘腦通路、腦干網狀結構、隔核進入海馬〔12〕。還有研究表明，海馬CA1區與聽皮層存在直接的神經聯系〔13〕。因此，海馬和聽皮層是研究老年性聾與認知功能障礙關系必不可少的部位。BDNF即腦源性神經營養因子，是在腦內合成的一種蛋白質，廣泛分布于中樞和外周神經系統，在神經元的存活、分化、生長發育中起重要作用，與學習記憶功能及AD等疾病密切相關，通常與TrkB蛋白相結合產生作用〔14～16〕。TrkB是一種在腦組織中表達很高的蛋白激酶，是BDNF的受體，對于神經發展的突觸功能有重要作用〔17〕。研究表明，AD腦組織中TrkB表達顯著下降〔18〕。BDNF/TrkB通路在認知功能及AD的作用已經得到證實〔19〕，但在聽覺系統中的作用尚未見報道。本研究結果提示TrkB蛋白磷酸化抑制可能參與C57BL/6J小鼠聽功能和認知功能下降。BDNF 自身表達無明顯變化，可能機制是BDNF通過結合TrkB，使TrkB磷酸化，其磷酸化位點募集下游效應因子，從而激活下游信號通路〔20〕。

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3 Gates GA,Beiser A,Rees TS,etal.Central auditory dysfunction may precede the onset of clinical dementia in people with probable Alzheimer′s disease〔J〕.J Am Geriatr Soc,2002;50(3):482-8.

4 Yu YF,Zhai F,Dai CF,etal.The relationship between age-related hearing loss and synaptic changes in the hippocampus of C57BL/6J mice〔J〕.Exp Gerontol,2011;46(9):716-72.

5 Wayne RV,Johnsrude IS.A review of causal mechanisms underlying the link between age-related hearing loss and cognitive decline〔J〕.Ageing Res Rev,2015;23(Pt B):154-66.

6 Fortunato S,Forli F,Guglielmi V,etal.A review of new insights on the association between hearing loss and cognitive decline in ageing〔J〕.Acta Otorhinolaryngol Ital,2016;36(3):155-66.

7 Bielefeld EC,Tanaka C,Chen GD,etal.Age-related hearing loss:is it a preventable condition〔J〕.Hear Res,2010;264(1-2):98-107.

8 Wong PC,Jin JX,Gunasekera GM,etal.Aging and cortical mechanisms of speech perception in noise〔J〕.Neuropsychologia,2009;47(3):693-703.

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11 Zhong Y,Hu Y,Peng W,etal.Age-related decline of the cytochrome c oxidase subunit expression in the auditory cortex of the mimetic aging rat model associated with the common deletion〔J〕.Hear Res,2012;294(1-2):40-8.

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20 Lai KO,Wong AS,Cheung MC,etal.TrkB phosphorylation by Cdk5 is required for activity-dependent structural plasticity and spatial memory〔J〕.Nat Neurosci,2012;15(11):1506-15.

〔2017-01-13修回〕

(編輯 李相軍)

Mechanisms of cognitive function decline of the presbycusis mice model

FANG Yi-De, HE Zu-Yan, CHEN Dan,etal.

Experimental Teaching Center, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 201203, China

Objective To observe the cognitive function decline and the mechanisms of presbycusis mice model.Methods The male C57BL/6J mice aged 3 months (young) and 12 months (middle-aged) were used. Auditory brainstem response (ABR) was used to test the hearing function. Morris water maze was used to examine the spatial learning and memory. Western blot was used to examine the BDNF and p-TrkB protein expression.Results ABR showed that the hearing threshold levels of 12 months old mice at 8,16,24 and 32 kHz were higher than those of 3 months old mice (P<0.01). The hidden platform test showed that the latency of 12 months old group was higher than that of 3 months old group from the third training day to the fifth training day (P<0.01, P<0.05). In probe test, the numbers of platform location crossing in 12 months old group increased significantly compared to that of 3 months old group (P<0.05). Western blot showed that the expression levels of p-TrkB in 12 months old group decreased significantly compared to 3 months old group. The expression of BDNF had no difference between two groups.Conclusions The significant cognitive decline is found in C57BL/6J mice, which might be related to the early onset of presbycusis. The phosphorylation of TrkB in hippocampus and auditory cortex might be one of the mechanisms.

Presbycusis; Cognitive decline; Hippocampus; Auditory cortex

國家自然科學基金資助項目(81102695)；上海市教委科研創新項目(14YZ064)

董 楊(1980-)，女，副教授，主要從事中醫藥防治老年病的研究。

方儀德(1996-)，男，中西醫結合臨床醫學本科生，主要從事中西醫結合學研究。

R764.4；R592

A

1005-9202(2017)13-3124-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.13.002