腫瘤壞死因子-α表達與腦出血患者神經細胞凋亡的相關性研究

盧艷秋 常克亮 王生鋒 劉曉靜 劉小軍

鄭州大學第二附屬醫院重癥醫學科，河南 鄭州 450014

腫瘤壞死因子-α表達與腦出血患者神經細胞凋亡的相關性研究

盧艷秋 常克亮 王生鋒 劉曉靜 劉小軍

鄭州大學第二附屬醫院重癥醫學科，河南 鄭州 450014

目的 探討腦出血患者炎性因子表達與細胞凋亡的關系。方法 選取腦出血患者48例，登記臨床資料并檢測血腫周圍腦組織TNF-α的不同時間段的表達。測定TNF-α表達：(1)Western Blot法；(2)免疫組化法。測定細胞凋亡：TUNEL法。結果 TNF-α的表達高峰期為0～24 h、13～48 h，TUNEL法測定神經細胞凋亡高峰期為13～48 h，表明腦出血后神經細胞凋亡與TNF-α的表達高峰完全一致，存在時間變化規律一致性。以凋亡細胞數為縱軸，TNF-α表達陽性細胞數為橫軸制作散點圖。胞質TNF-α陽性細胞數與凋亡細胞數相關系數r為0.954，呈明顯正相關。結論 腦出血患者血腫周圍腦組織TNF-α表達水平與神經細胞凋亡數一致。

TNF-α；腦出血；神經細胞；凋亡

神經細胞的凋亡是腦出血后繼發性損害的主要表現形式，也是神經功能損害的主要誘因，能夠促進神經功能損傷的進行性發展[1]。炎性反應是腦出血后繼發性神經損傷的重要作用機制，研究表明，NF-κB對多種炎性細胞因子的陽性表達水平、炎癥反應發展及神經細胞損傷具有至關重要的作用[2]。TNF-α作為NF-κB的下游因子是炎性反應過程的重要參與元素[3]。本研究旨在觀察48例腦出血患者的臨床資料及血腫周圍腦組織TNF-α的時間表達規律和神經細胞凋亡的時間周期規律，探討炎性因子TNF-α表達與神經細胞凋亡的關系。

1 資料與方法

1．1 一般資料 選取2013-11—2015-11鄭州大學第二附屬醫院神經外科收治的腦出血患者48例為研究組，男29例，女19例，年齡32～73歲，術前GCS評分13～14分5例，9～12分29例，3～8分14例。選取同期收治的需皮層造瘺行腦室手術治療的良性疾病患者10例為對照組，男6例，女4例，年齡29～70歲。所有研究標本均為正常手術中血腫周圍破碎腦組織。研究組取皮層造瘺距離血腫周圍1 cm處腦組織，對照組取皮層瘺口通道灰白質交界處的腦組織。

1．2 方法

1．2．1 研究組：根據術中取材時間與初發病時間間隔，將研究組分為6組各8例：0～6 h為1組，7～12 h為2組，13～24 h為3組，25～48 h為4組，49～96 h為5組，>96 h為6組。

1．2．2 Western Blot法：①預實驗檢測方法可信度；②提取細胞核蛋白、胞漿蛋白；③配制SDS-PAGE膠；④轉膜；⑤免疫反應；⑥化學發光、顯影、定影；⑦1D Image Analysis Software定量分析。

1．2．3 免疫組化法：制作石蠟切片行HE染色，然后按試劑盒步驟進行免疫組化檢測，于400倍高倍顯微鏡下觀察，隨機選擇5個無重復視野，進行TNF-α陽性細胞計數，以總和陽性細胞數作為測量值。

1．2．4 測定細胞凋亡：采用TDT介導下的dUTP缺口末端標記測定法(即TUNEL法)測定細胞凋亡水平。

2 結果

2．1 Western Blot法測定各組TNF-α表達水平及時間變化比較 TNF-α出血后表達水平顯著升高，研究組3組TNF-α表達水平為最高峰，與4組表達水平差異無統計學意義(P3/4>0.05)，與其他各研究組比較差異有統計學意義(P1/3、P2/3、P3/4<0.05)。見表1。

表1 各組TNF-α表達水平比較

2．2 免疫組化法測定TNF-α的表達水平及時間變化比較 研究組4組TNF-α陽性表達細胞數最多，與3組比較差異無統計學意義(P3/4>0.05)，與其他各研究組比較差異均有統計學意義(P2/4<0.05，P1/4、P4/5<0.01)。出血后13～48 h為TNF-α的表達高峰期。見表2。

表2 免疫組化法測定TNF-α表達水平

2．3 TUNEL法測定血腫周圍腦組織神經細胞凋亡情況及時間變化 研究組樣本在光鏡下查見大量棕色凋亡細胞，而對照組中凋亡細胞極為罕見。提示研究組神經細胞凋亡數顯著多于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 TUNEL檢測法測定研究組及對照組腦組織神經細胞凋亡情況

2．4 細胞凋亡與TNF-α表達水平的關系 TNF-α的表達高峰期為13～48 h，Western Blot法及免疫組化法測定結果一致。TUNEL法測定神經細胞凋亡高峰期為13～48 h，表明腦出血后神經細胞凋亡與TNF-α的表達高峰完全一致。以凋亡細胞數為縱軸，TNF-α表達陽性細胞數為橫軸制作散點圖。胞質TNF-α陽性細胞數與凋亡細胞數相關系數R為0.954，呈明顯正相關。見圖1。

圖1 胞漿TNF-α陽性細胞數

3 討論

炎性因子是一種高生物活性的小分子多肽，TNF-α可啟動細胞因子系統進一步誘發機體代謝異常、血管通透性、血流動力學異常等過程。胡利華等[4]研究顯示，腦出血后TNF-α的表達水平即顯著升高，TNF-α陽性表達細胞數增多。趙衛海等[5]發現腦出血后血腫周圍腦組織TNF-α陽性表達水平與炎性細胞數呈正相關。

本研究結果表明，TNF-α的表達高峰期分別為0～24 h、13～48 h，Western Blot法及免疫組化法測定結果一致。TUNEL法測定神經細胞凋亡高峰期為13～48 h，表明腦出血后神經細胞凋亡與TNF-α的表達高峰完全一致，以凋亡細胞數為縱軸，TNF-α表達陽性細胞數為橫軸制作散點圖，胞漿TNF-α陽性細胞數與凋亡細胞數呈明顯正相關。

本研究結果印證了腦出血后神經細胞凋亡與TNF-α蛋白質表達水平、mRNA表達等因素有關，而神經細胞凋亡情況與腦出血患者遠期預后、神經功能損傷水平有關，因而調控、阻斷、降低IL-1β、TNF-α的蛋白質表達水平、mRNA表達及轉錄可能對降低神經功能損傷嚴重程度或改善腦出血患者遠期預后有重要意義。但本研究例數相對較少，存在一定局限性，有待大規模臨床研究進一步證實相關結論。且本研究結果提示，未來研究方向應針對采用特異性活性抑制劑、RNA干擾劑、RNA抑制劑、蛋白質抑制劑及基因表達阻斷等相關技術阻斷或降低TNF-α的陽性表達水平，以期探索更為針對有效治療腦出血患者神經功能損傷的治療手段。同時，應進一步研究TNF-α等炎性因子對神經細胞凋亡的作用機制，為治療手段研究奠定基礎。

[1] Chen J，Wang L，Wu C，et al．Melatonin-enhanced autophagy protects against neural apoptosis via a mitochondrial pathway in early brain injury following a subarachnoid hemorrhage[J]．J Pineal Res，2014，56(1)：12-19．

[2] Zhou C，Xie G，Wang C，et al．Decreased progranulin levels in patients and rats with subarachnoid hemorrhage：a potential role in inhibiting inflammation by suppressing neutrophil recruitment[J]．J Neuroinflammation，2015，12：200．

[3] 陳光丑．顱腦損傷早期血清炎性細胞因子的變化與預后關系分析[J]．浙江創傷外科，2014，19(6)：889-891．

[4] 胡利華，吳江，杜丹華，等．實驗性腦出血急性期灶周組織水腫及炎性細胞因子的表達[J]．中風與神經疾病雜志，2006，23(5)：552-554．

[5] 趙衛海，海陳煉，余國棟．血清TNF-α IL-1 IL-6 IL-8在急性顱腦損傷后含量變化及意義[J]．中國實用神經疾病雜志，2013，16(16)：22-23．

(收稿2017-03-14)

R743.34

A

1673-5110(2017)12-0062-02