T—RFLP指紋圖譜技術分析細菌型微生物肥料菌種穩定性

魏霜 劉建華 吳西源 黃帥 周陸寧 林春貴 吳希陽 劉中勇

摘要 [目的]建立一種分析微生物肥料菌種穩定性的T-RFLP指紋圖譜技術。[方法]采用T-RFLP指紋圖譜技術對進口細菌型微生物肥料菌種的穩定性進行分析。[結果]樣品中優勢菌的T-RFs片段主要是87、246、247、330 bp，其中330 bp為主要片段，Shannon多樣性指數和均一性指數測定結果表明，不同批次產品間差異性較小，微生物群落結構較穩定。[結論]建立了微生物肥料菌種穩定性分析的T-RFLP指紋圖譜技術，為進出口微生物肥料產品提供了一種快速分析方法。

關鍵詞 T-RFLP；微生物肥料；穩定性

中圖分類號 S144 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2017）01-0143-02

TRFLP Analysis for Stability of Bacterial Microbial Fertilizers

WEI Shuang1，LIU Jianhua2，WU Xiyuan3，LIU Zhongyong1* et al

（1.Shantou EntryExit Inspection and Quarantine Bureau，Shantou，Guangdong 515041；2.Standard and Technical Regulation Research Center of AQSIQ，Beijing 100028；3.Guangzhou Airport EntryExit Inspection and Quarantine Bureau，Guangzhou，Guangdong 510000）

Abstract [Objective] The aim was to establish a TRFLP technique for the stability of bacterial microbial fertilizers.[Method] We used terminal restriction fragment length polymorphism （TRFLP） technique to analyze the stability of import microbial fertilizers.[Result] The TRFs fragments with the sizes of 87，246，247 and 330 bp were the dominant bacteria.The TRFs fragments with the sizes of 330 bp was the most important dominant bacteria.The Shannon diversity index and evenness index show that the diversity between the different batches of products was small.The community of bacterial of products were stability.[Conclusion] A TRFLP technique has been developed for analyze the stability of microbial fertilizers，which can be used for the import or export of microbial fertilizers.

Key words TRFLP；Microbial fertilizers；Stability

化肥的使用使農產品的品質下降，營養價值、適口性降低，蔬菜硝態氮超標、亞硝態氮積累超標；還引起江河湖泊的富營養化，破壞土壤結構，致使土壤中有機質減少，保存養分、水分的能力下降，易發生風蝕和荒漠化[1]。微生物肥料是1種或多種功能微生物經工業化生產增殖后直接使用，或者濃縮或經載體吸附而制成的活菌制品。它具有多方面的優點：土壤團?；巴寥栏牧?、增加植物抗逆境能力；促進分解有機物質；防除病害，減少農藥的需求；連續造肥作用，提供植物吸收，如氮肥制造、達成肥分的可溶性、提供有機營養等；解除毒素促進植物生長；增進肥效[2-3]。微生物肥料不僅可以促進植物生長，提高產量，而且還能夠解決因長期使用化肥而造成的一系列生態環境問題，微生物肥料在綠色有機食品生產、農業生態環境保護以及高產、優質、高效農業的持續發展中發揮著重要作用。

當進出口微生物肥料量較大時，對批批產品都按照標準的傳統分離培養鑒定檢測流程進行檢驗檢疫的工作量大，因此，探尋一種快速、自動化、準確的微生物肥料產品篩檢技術對該類產品通關速度的加快具有重要意義。李朔[4]利用PCR-DGGE指紋圖譜技術研究了微生物肥料培養過程中菌群的變化，同時還分析了微生物肥料施用過程中土壤的生物多樣性變化；李武等[5]利用PCR-DGGE指紋圖譜技術對同一生產批次3個不同包裝樣品的細菌和真菌群落進行分析，建立了對微生物肥料質量進行評估和檢測的方法。T-RFLP是建立在PCR、RFLP等技術和DNA片段分析技術不斷完善的基礎上，由這些技術的融合產生的一種全新、快速、有效的微生物群落結構分析方法。該技術已被成功應用于菌種的鑒定、各種微生物群落的比較分析、微生物群落多樣性及結構特征的研究等方面，是目前很有前景的微生物群落指紋圖譜分析技術[6-8]。筆者利用微生物肥料中微生物群落的T-RFLP指紋圖譜技術，分析了微生物肥料產品菌種組成穩定性，以便對大規模微生物肥料樣品進行快速分析。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗所用的樣品為進口液體微生物肥料，自廣東汕頭國際集裝箱碼頭分3批進口，來源于美國，每批次取3個樣品，分別是2015年11月（A1、A2、A3）、2016年5月（B1、B2、B3）、2016年7月（C1、C2、C3）進口。PCR產物純化試劑盒為天根生化科技有限公司產品。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA的提取。

采用試劑盒法提取樣品基因組DNA，取1 mL樣品，12 000 r/min離心5 min，去除上清液，按照DNA提取試劑盒說明書中的操作步驟進行提取，提取出的DNA保存于-20 ℃冰箱中。

1.2.2 PCR擴增及產物純化。

選用細菌16S rRNA通用引物8F/1492r，8F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG，1492r：ACGGTTACCTTGTTACGACTT，其中8F的5′端進行FAM熒光標記。反應體系包括：10×PCR Buffer緩沖液5.00 μL、dNTPs溶液4.00 μL，各引物終濃度均為0.2 μmol/L，DNA模板2.00 μL、Ex Taq酶0.25 μL，ddH2O調節最終體積至50.00 μL。反應條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，52 ℃ 45 s，72 ℃ 90 s，35個循環；72 ℃ 10 min。PCR擴增產物采用PCR產物純化試劑盒進行純化，后經2.0%瓊脂糖電泳后，用凝膠成像系統觀察并拍照。

1.2.3 酶切及T-RFs分析。

純化后的PCR產物采用Hha Ⅰ進行酶切，方法根據相應內切酶的使用說明書進行。反應體系：10×M Buffer緩沖液0.50 μL，內切酶4.00 μL，PCR產物6.00 μL，ddH2O調節最終體積至40.00 μL。在37 ℃下消化6 h，反應完成后，Hha Ⅰ 在65°C水浴20 min失活，酶切后的產物送生工生物工程（上海）股份有限公司進行基因掃描，得到T-RFLP圖譜。

1.2.4 數據處理。

T-RFLP圖譜中數據處理，去除小于50 bp或大于500 bp的片段以及峰面積占總峰面積0.5%的片段。核糖核酸豐度指數（S）相當于限制性片段圖譜中差異片段的總數；Shannon多樣性指數（H）和均一度指數（E）根據Mills等[9]的方法計算。采用BIO-DAP軟件計算樣品之間的Jaccard 相似度指數，用于評價2個樣品微生物群落的相似度。

2 結果與分析

2.1 T-RFLP數據初步分析

根據T-RFLP掃描結果統計T-RFs片段長度，挑選出片段峰面積占總峰面積比例超過10%作為優勢片段，結果見表1。9個樣品T-RFs片段數量為4～9個，片段大小集中在64～363 bp，優勢T-RFs片段長度主要是87、246、247、330 bp，其中330 bp片段所占比例最大，集中在40.63%～74.81%，說明產品中優勢菌株較穩定。

2.2 多樣性分析

由表2可知，C批次樣品T-RFs總片段數大于B批次樣品，B批次樣品T-RFs總片段數大于A批次樣品，但結合峰面積比例計算出的Shannon多樣性指數和均一性指數來看，大部分樣品Shannon多樣性指數集中在10～1.5，均一性指數集中在0.6～0.9，樣品的微生物多樣性變化不大，產品的微生物群落結構較穩定。

2.3 相似性分析

由表3可知，所有樣品之間Jaccard相似度指數集中在0.250～0.857，A批次樣品之間Jaccard相似度指數在0.400～0.750，B批次樣品之間Jaccard相似度指數在0.400～0.750，C批次樣品之間Jaccard相似度指數在0625～0.857。

3 結論

建立了用于細菌型微生物肥料中微生物群落分析的T-RFLP指紋圖譜技術。結果表明，汕頭口岸進口的微生物肥料菌株結構較穩定，優勢菌種穩定且占整個群落結構的比例較高；該方法快速，在1 d之內能得到分析結果，比傳統平板培養法更簡便，可用于進出口微生物肥料產品菌落穩定性的初篩。

參考文獻

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