14個多年生黑麥草品種幼苗期對鹽脅迫的生理響應

魏曉艷 梁丹妮 龐丁銘 蘭劍

（1.寧夏大學農學院，寧夏銀川 750021；2.寧夏大學西北土地退化與生態恢復國家重點實驗室培育基地，寧夏銀川 750021）

摘要 [目的] 研究14個多年生黑麥草品種幼苗期對鹽脅迫的生理響應。[方法]采用盆栽法研究了不同鹽（NaCl）濃度脅迫對14個多年生黑麥草（Lolium perenne L.）品種幼苗期葉綠素含量、丙二醛含量、可溶性糖含量、脯氨酸含量和過氧化氫酶活性5個生理生化指標的影響，并運用隸屬函數方法對14個多年生黑麥草品種的耐鹽性進行了綜合評價。[結果]隨著鹽脅迫的加強，不同品種多年生黑麥草幼苗期葉綠素含量總體呈現下降趨勢，丙二醛含量總體呈上升趨勢，可溶性糖含量品種間變化趨勢無規律，脯氨酸含量呈增長趨勢，過氧化氫酶活性先升后降；不同品種的耐鹽性強弱依次為凱蒂沙、球道、天馬、匹克威、新速2號、全順、金牌美達利、德北極品、啟萌、愛神特、雷神4、守門員、龍卷風、博士。[結論]凱蒂沙的耐鹽性較好，可在寧夏鹽漬化地區草坪建植中推廣運用。

關鍵詞 多年生黑麥草；幼苗期；抗鹽性；生理生化指標

中圖分類號 S543+.6 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2017）01-0008-05

Physiological Responses of 14 Cultivars of Perennial Lolium perenne L. to Salt Stress during Seedling Stage

WEI Xiaoyan1， LIANG Danni1， PANG Dingming1， LAN Jian1，2*

（1.College of Agronomy， Ningxia University， Yinchuan， Ningxia 750021；2.State Key Laboratory Breeding Base of Land Degradation and Ecological Restoration of Northwest China， Ningxia University，Yinchuan， Ningxia 750021）

Abstract [Objective] To research the physiological responses of 14 cultivars of perennial Lolium perenne L. to salt stress during seedling stage. [Method] Pot method was used to research the effects of different concentrations of NaCl stress on the five physiological and biochemical indexes of chlorophyll （Chl） content， malondialdehyde （MDA） content， soluble sugar （SS） content， proline （Pro） content and catalase （CAT） activity of 14 L. perenne cultivars at seedling stage. And salt tolerance of the 14 perennial cultivars were comprehensively evaluated by membership function method. [Result] With the increase of salt stress concentration， chlorophyll contents in different cultivars decreased， and MDA content showed upward trend in general. There were no rules for the change trend of soluble sugar content. Proline content increased， catalase activity decreased firstly and then declined. Salt tolerance of different cultivars from big to small was in the order of Caddy sand， Fairway， Tianma， Pickwick， Newspeed 2， Quanshun， Jinpaimeidali， Debeijipin， Qimeng， Accent， Raytheon 4， Goalkeeper， Tornado， Doctor. [Conclusion] Caddy sand showes relativley good salt tolerance， which can be extended in lawn planting in Ningxia salinization area.

Key words Perennial Lolium perenne L.；Seedling stage；Salt tolerance；Physiological and biochemical indexes

鹽土是鹽堿土中面積較大的類型之一，我國主要分布在甘肅、青海、寧夏等省和自治區地勢低平的盆地和平原中。當前，土壤鹽漬化已成為我國乃至世界主要的環境問題之一[1-3]。土壤中的鹽分是影響植物生長發育的重要限制因子，其主要脅迫因子包括Na+和Cl-，其中氯化物為主的鹽土毒性較大，其含鹽量的下限為0.6%。土壤鹽漬化嚴重影響了我國，特別是西北地區的農業生產和生態環境，制約了畜牧業的發展。寧夏位于西北地區東部、黃河中上游，地處中溫帶半干旱、干旱區，降水稀少，蒸發強烈，溶解在水中的鹽分容易在土壤表層積聚。寧夏鹽堿土主要分布在北部引黃灌區，鹽漬化面積達24.06萬hm2，占現有耕地面積的4893%，其中輕級、中級、重級鹽漬區的比例分別為2.1∶1.4∶1.0[4]，是導致該地區中低產的主要限制因子之一[5]。近年來，土壤鹽漬化已成為影響寧夏農業和畜牧業生產的重要問題之一，解決土壤鹽漬化問題已迫在眉睫。多年生黑麥草（Lolium perenne L.）是一種重要的禾本科牧草和草坪草。在耐鹽性方面，禾本科牧草通常優于豆科牧草和作物[6]，具有適應性好、耐鹽性強的特性，是改良和利用鹽堿地的良好植物。黑麥草既可做美化環境的草坪草，又可為牛羊提供優質的飼草，還可有效地改良寧夏地區大面積的鹽堿地。因此，篩選出適合寧夏氣候條件的黑麥草耐鹽品種，為鹽漬化地區草地建設提供優良的種植材料具有深遠的意義。鑒于此，該試驗選取14個黑麥草屬多年生黑麥草品種，研究其在不同鹽濃度脅迫下幼苗期的生理指標，并進行抗鹽性綜合評價，旨在選出較適宜寧夏鹽漬化地區的種植品種。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗材料為多年生黑麥草，包括匹克威、啟萌、德北極品、凱蒂沙、守門員、雷神4、龍卷風、全順、金牌美達利、新速2號、天馬、球道、愛神特、博士14個品種。

1.2 試驗方法

2016年6月1—30日，在寧夏大學農學院草業科學實驗室進行試驗。試驗采用盆栽試驗與實驗室測定相結合的方法。在鹽脅迫下進行苗期盆栽試驗，按每盆土樣的0.3%、0.6%、0.9%、1.2%、1.5%加化學純NaCl進行處理，設3次重復。處理后第30天取樣，取樣時間為08：00—10：00。取樣后迅速將樣品冷凍在-20 ℃的低溫冰箱中，以備測定生理生化指標。

取非鹽堿地大田土壤過篩，并裝入無孔塑料花盆（高12.5 cm，底徑12.0 cm，口徑15.5 cm），每盆裝土1.5 kg，同時取樣測定其含水率，以確定實際每盆裝入的干土重一致?；ㄅ柚糜趯嶒炇覂?。根據種子發芽率的高低，每個花盆播種30～40粒，出苗后間苗，2葉定苗，留生長整齊一致、分布均勻的20株幼苗。

1.3 測定方法及指標

5項生理生化指標的測定參照李合生[7]的方法，在此基礎上，根據該試驗的實際情況，用大量的預試驗摸索經驗，在一些地方做了相應的調整或進行了綜合。

1.3.1 葉綠素（Chl）含量測定。

采用95%乙醇提取法。按下列公式計算葉綠素的含量：

Chla濃度（mg/L）= 13.95A665-6.88A649

Chlb濃度（mg/L）= 24.96A649-7.32A665

色素含量（mg/g）=（色素濃度×25×0.001）/樣品鮮重

式中，A649、A665分別為葉綠素提取液在649和665 nm處的吸光值。

1.3.2 丙二醛（MDA）含量測定。

采用TBA-MDA顯色法。按下列公式計算MDA含量：

MDA濃度（μmol/L）=6.45（A532-A600）-0.56A450

MDA含量（μmol/g）=[ MDA濃度×（5/2）×0.001]/樣品鮮重

式中，A450、A532和A600分別為MDA顯色反應液在450、532和600 nm處的吸光值。

1.3.3 可溶性糖含量測定。

采用80%乙醇提取液蒽酮比色法。按下列公式計算樣品可溶性糖含量：

可溶性糖含量C（μg/g）=AN/W

式中，A為標準曲線中得到的可溶性糖含量（μg/g）；N為稀釋倍數；W為樣品重量（g）。

1.3.4 脯氨酸（Pro）含量測定。

采用酸性茚三酮法。按下列公式計算脯氨酸含量：

Pro濃度（μg/2 mL）= 45.308A520-0.091

（脯氨酸標準曲線為：Y=45.308X-0.091）

Pro含量（μg/g）= [Pro濃度×（5/2）]/樣品鮮重

式中，A520為甲苯萃取液在520 nm處的吸光值。

1.3.5 過氧化氫酶（CAT）活性測定。

采用高錳酸鉀滴定法。按下列公式計算CAT活性：

被分解的H2O2（mg/mL）=[（VCK-V差）×CKMnO4×（5/2）×34] / 1

CAT活性 [mg/（g·min）] =（被分解的H2O2×5）/（樣品鮮重×10）

式中，VCK為對照（無酶液）所消耗的KMnO4體積（mL）；

V差為有酶液時所消耗的KMnO4體積（mL）；

CKMnO4為KMnO4濃度（mol/L）。

1.4 耐鹽性綜合評價方法

用模糊數學隸屬法進行耐鹽性綜合評價，公式為：

X（U）=（X-Xmin）/（Xmax- Xmin）（1）

X（U）=1-（X-Xmin）/（Xmax- Xmin）（2）

式中，X 為參試植物某一耐鹽指標的測定值，Xmax 為該指標中的最大值，Xmin 為該指標中的最小值。若某一指標與耐鹽性呈正相關，用公式（1）；如果某一指標與耐鹽性呈負相關，可通過公式（2）反隸屬函數計算其耐鹽性隸屬函數值，先求出各份材料各個耐鹽指標在不同鹽濃度下的隸屬值，然后把每一指標在不同濃度下的隸屬值累加求平均值，再將每一材料各耐鹽指標的隸屬值累加，求其平均值。通過比較各材料的耐鹽隸屬值的平均值大小，確定其耐鹽性的強弱[8]。試驗中將參試的不同品種多年生黑麥草與抗鹽性有關的指標采用隸屬函數進行綜合分析，計算不同材料的各指標的隸屬值，并以各材料的平均隸屬函數值作為抗鹽鑒定綜合評價指標。

1.5 數據分析

采用DPS v8.01版軟件進行不同品種間的顯著性檢驗，使用Microsoft Excel 2003軟件進行制表、制圖、數據計算及隸屬函數分析。

2 結果與分析

2.1 鹽脅迫對不同品種多年生黑麥草葉綠素含量的影響

植物受到鹽脅迫時，各種生理過程受到干擾，造成水分虧缺、膜系統結構破壞、有害代謝產物累積、蛋白質合成下降等變化，這些均直接影響葉綠素含量的變化[9]。鹽脅迫下植株體內的葉綠素酶活性增強，促進了葉綠素b的降解，使植株葉片的葉綠素含量降低[10]。由表1可知，隨著脅迫的加強，除凱蒂沙呈上升趨勢外，其他品種的多年生黑麥草幼苗期葉綠素含量總體呈現下降趨勢。當鹽濃度為1.2%時，守門員、全順、天馬及愛神特4個品種的葉綠素含量下降幅度較大，分別為-38.38%、-31.59%、-25.92%、-24.16%；當鹽濃度為1.5%時，啟萌、徳北極品、金牌美達利、新速2號和博士共5個品種的葉綠素含量下降幅度較大，分別為-27.98%、-26.55%、-7.86%、-34.86%、-7.28%。當鹽濃度達12%時，雷神4與守門員、全順、球道差異極顯著（P<0.01），且葉綠素含量較高，抗鹽性較強；當鹽濃度達15%時，全順與雷神4、天馬的差異極顯著（P<0.01），葉綠素含量最低，抗鹽性較差。

2.2 鹽脅迫對不同品種多年生黑麥草丙二醛含量的影響

丙二醛含量的高低可以反映細胞質過氧化的程度和植物對逆境條件反應的強弱[11]。抗逆性越強的植株丙二醛含量上升幅度越小[12]。由表2可知，隨著鹽濃度的增加，除天馬呈現下降趨勢外，其他品種多年生黑麥草的丙二醛含量總體呈上升趨勢。當鹽濃度為1.2%時，啟萌、守門員、雷神4、龍卷風、全順的丙二醛含量達最大值；當鹽濃度達15%時，啟萌、徳北極品、凱蒂沙等9個品種的丙二醛含量上升平緩，甚至下降，說明1.2%～1.5%的鹽濃度可能是這幾個品種的抗鹽臨界濃度。

2.3 鹽脅迫對不同品種多年生黑麥草可溶性糖含量的影響

可溶性糖是植物體內的主要滲透調節劑，不僅可穩定細胞膜和原生質體，還可在細胞內無機離子濃度高時保護酶類，可溶性糖含量高說明抗鹽性強[13]。由表3可知，隨著鹽濃度的增加，可溶性糖含量變化：啟萌、徳北極品、凱蒂沙呈“W”型趨勢；守門員、雷神4、龍卷風、全順、金牌美達利、天馬、球道、愛神特、博士呈“M”型趨勢；匹克威呈倒“N”型趨勢；新速2號呈倒“V”型趨勢?？梢?，隨著鹽脅迫濃度的升高，品種間變化趨勢不同，無規律性。多年生黑麥草各品種可溶性糖含量變化的多樣性反映了品種間存在較大的種質差異。當鹽濃度為1.5%時，匹克威的可溶性糖含量與其他品種差異極顯著（P<0.01），且該品種的可溶性糖含量最低，為0.26 μg/g，表明該品種的抗鹽性較弱。

2.4 鹽脅迫對不同品種多年生黑麥草脯氨酸含量的影響

植物在鹽脅迫等逆境條件下會積累脯氨酸，且脯氨酸含量越高，抗性越強[14]。一般情況，脯氨酸含量上升越快，幅度越大，說明植物的抗性越強[15]。由表4可知，隨著鹽濃度的增大，14個多年生黑麥草品種的脯氨酸含量總體呈增長趨勢。當鹽濃度為1.5%時，匹克威、啟萌、徳北極品、全順、球道、愛神特6個品種的脯氨酸含量上升幅度較大，分別為37839%、99.47%、85.04%、388.93%、68.61%、78.61%。其中，匹克威和全順的脯氨酸上升幅度比其他品種高4倍以上，說明匹克威和全順的抗鹽性較好。當鹽濃度為1.2%時，雷神4與其他品種的差異達到了極顯著水平（P<0.01）；在鹽濃度為1.5%時，多年生黑麥草的14個品種間的差異都不顯著（P>0.05），說明當鹽濃度增加到1.5%時破壞了黑麥草的細胞結構，使得黑麥草的抗鹽性減弱。

2.5 鹽脅迫對不同品種多年生黑麥草過氧化氫酶活性的影響

過氧化氫酶可以將超氧化物歧化酶等產生的H2O2轉化為H2O，是清除活性氧的關鍵，與SOD協同作用[16]。由表5可知，隨著鹽濃度的增加，不同品種多年生黑麥草的過氧化氫酶活性呈先升后降的趨勢。當鹽濃度從0.3%逐漸增加到1.2%時，過氧化氫酶活性呈增長趨勢；但當鹽濃度增加到15%時，過氧化氫酶活性總體呈下降趨勢。當鹽濃度為1.5%時，新速2號與金牌美利達、球道的差異達極顯著水平（P<001）；但與其他品種的差異未達顯著水平（P<0.05），且該品種的過氧化氫酶活性最差，說明新速2號的抗鹽性較差。

2.6 14個多年生黑麥草品種的抗鹽性綜合評價

隸屬函數綜合評價值反應了各多年生黑麥草品種間的綜合抗鹽性能力的大小，數值越大表明其越耐鹽[8]。由表6可知，不同品種抗鹽性由強到弱的順序為凱蒂沙、球道、天馬、匹克威、新速2號、全順、金牌美達利、德北極品、啟萌、愛神特、雷神4、守門員、龍卷風、博士。

3 結論與討論

隨著鹽濃度的增加，14個多年生黑麥草品種的葉綠素含量總體呈下降趨勢，這與前人[16]研究結果一致。隨著鹽脅迫的增強，除凱蒂沙呈上升趨勢外，其他品種的多年生黑麥草葉綠素含量總體呈現下降趨勢，造成這一現象的原因有可能是凱蒂沙的抗鹽性較好，1.5%鹽濃度還未對其造成傷害，也有可能是試驗過程中出現了失誤。鹽脅迫會使植物的生理過程受到干擾，降低水勢，破壞膜系統，積累有害代謝產物，這些都有可能直接或間接地造成葉綠素含量下降。14個多年生黑麥草品種的丙二醛含量隨著鹽脅迫的加強，總體呈上升趨勢，這與趙功強等[17]、周志紅[18]的研究結果一致。丙二醛是植物抵抗鹽脅迫的重要滲透調節物質，其含量的增高可提高對鹽脅迫的抵抗能力，從而維持細胞的正常代謝，使植物具有一定的抗鹽性。張改過[13]、李淑梅等[19]研究顯示，黑麥草在鹽脅迫下可溶性糖含量呈上升趨勢。該試驗結果顯示，隨著鹽濃度的增加，14個多年生黑麥草品種的可溶性糖含量總體呈上升趨勢。植物體內的可溶性糖是主要的滲透調節劑，鹽脅迫會使植物細胞的水勢升高，而可溶性糖的累積降低水勢，增強植物的抗鹽性。隨鹽濃度的增加，黑麥草各個品種的脯氨酸含量總體呈上升趨勢，這與李孔晨等[14]的研究結果一致。植物為了提高抗鹽性，會累積脯氨酸來降低細胞水勢，抵抗外界滲透脅迫，從而在鹽脅迫環境中生存。不同品種多年生黑麥草的過氧化氫酶活性隨著鹽濃度的增加呈先升后降的趨勢，其原因可能是當鹽濃度達到1.5%時，過高的鹽濃度，造成過氧化氫酶失活。該試驗結果顯示，隨著鹽脅迫程度的加劇，過氧化氫酶活性先上升后下降，這與李曉雅等[20]結果相符。

單一的指標間比較不能全面反映多年生黑麥草品種間抗鹽性的強弱，因此，該試驗綜合14個黑麥草品種5項抗鹽性指標，采用隸屬函數綜合評價其抗鹽能力，抗鹽性由強至弱的順序為凱蒂沙、球道、天馬、匹克威、新速2號、全順、金牌美達利、德北極品、啟萌、愛神特、雷神4、守門員、龍卷風、博士。其中，凱蒂沙的抗鹽性最好，博士的抗鹽性最差。因此，可初步考慮在寧夏地區推廣凱蒂沙品種來建植草坪、防風固沙、美化環境，同時該品種還能有效利用、改良該地區的大面積鹽漬地。

參考文獻

[1] MUNNS R.Genes and salt tolerance：Bringing them together[J].New phytologist，2005，167（3）：645-663.

[2] TESTER M，DAVENPORT R.Na+ tolerance and Na+ transport in higher plants[J].Annals of botany，2003，91（5）：503-527.

[3] ALSHAMMARY S F，QIAN Y L，WALLNER S J.Growth response of four turfgrass species to salinity[J].Agricultural water management，2004，66（2）：97-111.

[4] 李聰敏，王彥兵.寧夏引黃灌區耕地土壤鹽漬化現狀及影響因素調查研究[J].地下水，2007，29（3）：41-44.

[5] 鮑子云，仝炳偉.寧夏引黃灌區中低產田類型與改造措施[J].寧夏農林科技，2007（5）：123-124，133.

[6] 趙劍，馬福榮，楊文杰，等.高壓靜電場（HVEF）對大豆種子吸脹冷害的影響[J].生物物理學報，1995，11（4）：595-598.

[7] 李合生.植物生理生化實驗原理和技術[M].北京：高等教育出版社，2000：134-261.

[8] 陳德明，俞仁培，楊勁松.鹽漬條件下小麥抗鹽性的隸屬函數值法評價[J].土壤學報，2002，39（3）：368-374.

[9] 何惠琴，李紹才，孫海龍，等.4種草坪草種耐鹽性研究[J].四川師范大學學報（自然科學版），2010，33（1）：97-101.

[10] DEMMIGADAMS B，ADAMS W W Ⅲ.Photoprotection and other responses of plants to high light stress[J].Ann Rev Plant Physiol Plant Mol Biol，1992，43：599-626.

[11] JALEEL C A，SANKAR B，SRIDHARAN R，et al.Soil salinity alters growth，chlorophyll content，and secondary metabolite accumulation in Catharanthus roseus[J].Turkish journal of biology，2008，32（2）：79-83.

[12] 洪麗蕓，田大倫，李芳，等.不同灌溉方式對銀杏水分生理的影響[J].中國林業科技大學學報，2008，28（1）：49-52.

[13] 張改過.黑麥草耐鹽性的研究[J].山西農林科技，2009，38（2）：19-21.

[14] 李孔晨，盧欣石.黑麥草屬9個品種萌發及苗期耐鹽性研究[J].草業科學，2008，25（3）：111-115.

[15] 呂靜，劉衛東，王麗，等.4種暖季型草坪草的抗旱性分析[J].中國林業科技大學學報，2010，30（3）：100-104.

[16] BOWLER C，VAN MONTAGU M，INZ D.Superoxide dismutase and stress tolerance[J].Annual review plant physiology and plant molecular biology，1992，43（1）：83-116.

[17] 趙功強，趙萍.8個高羊茅品種幼苗期抗鹽性比較[J].安徽農業科學，2008，36（20）：8447-8449，8452.

[18] 周志紅.3種冷季型草坪草對鹽脅迫的生理響應[J].草原與草坪，2014，34（2）：81-85.

[19] 李淑梅，王付娟，董麗平，等.鹽分脅迫對黑麥草幼苗生理生化特性的影響[J].種子，2015，34（5）：95-97.

[20] 李曉雅，趙翠珠，程小軍，等.鹽脅迫對亞麻薺幼苗生理生化指標的影響[J].西北農業學報，2015，24（4）：76-83.