福建柏葉片全蛋白3種提取方法的比較

吳玉香 沈少炎 鄭郁善

摘要 [目的]探索適于福建柏蛋白質組學研究的全蛋白樣品制備的最優(yōu)方案。 [方法]以福建柏葉片為材料，利用3種全蛋白提取方法：TCA/丙酮法、酚提法和TCA/酚提結合法，研究不同提取方法對福建柏蛋白雙向電泳結果的影響。[結果]TCA/丙酮法制備的蛋白點數(shù)較少，為285個，蛋白質在制備過程中流失較多；酚提法得到的蛋白點最多，為1 226個，蛋白點較清晰但pH中端部分有輕微的蛋白堆積；TCA/酚提結合法得到了813個蛋白點，蛋白點較清晰，無明顯的蛋白堆積現(xiàn)象。[結論]在福建柏蛋白質組學研究中，酚提法更適于福建柏全蛋白的制備，且酚提法明顯優(yōu)于TCA/酚提結合法。

關鍵詞 福建柏；全蛋白；蛋白提取；雙向電泳

中圖分類號 S312 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2017）01-0135-04

Comparison of the Three Extraction Methods of Fokienia hodginsii Leaves Total Protein

WU Yuxiang1， SHEN Shaoyan1， ZHENG Yushan1，2*

（1.College of Landscape，F(xiàn)ujian Agriculture and Forestry University，F(xiàn)uzhou，F(xiàn)ujian 350002；2.College of Forestry，F(xiàn)ujian Agriculture and Forestry University，F(xiàn)uzhou，F(xiàn)ujian 350002）

Abstract [Objective] To study the most efficient method for sample preparation of Fokienia hodginsii proteomics. [Method] Three different methods including TCA/acetone，phenol extraction method and TCA/phenol extraction method were analyzed by separation effect of 2DE with Fokienia hodginsii leaves as material. [Result]The results showed that using TCA/acetone method，285 protein spots could be detected on 2DE gels which had severest loss in proteins. The phenol extraction method was the best with more clear protein spots as many as 1 226 protein spots on 2DE gels，but using protocol extraction method，there were slightly protein accumulation phenomena at neutral. TCA/phenol extraction method was produced 813 protein spots on 2DE gels with more clear protein spots and slight protein accumulation phenomena. [Conclusion]The phenol extraction method is efficient and optimal method for preparation of Fokienia hodginsii total protein， meanwhile the phenol extraction method is better than TCA/phenol extraction method.

Key words Fokienia hodginsii；Total protein；Protein extraction；2DE

在后基因組時代，蛋白質組學快速發(fā)展并成為研究基因表達及其功能的重要途徑[1]。隨著液相層析法技術的發(fā)展，雙向電泳（2-DE）在蛋白質組學中的應用逐漸減少[2]，但雙向電泳技術仍是獲得重復性好、可見性良好以及可信度高蛋白質的有效分離手段，尤其是在高復雜性蛋白質混合物的分離中應用廣泛[3]。在蛋白質組學研究中樣品的提取和準備是極其重要的第一步，在一些復雜生物樣本（如一些復雜的細菌原蛋白）的提取中，如果未采取適當?shù)姆椒▉慝@得高質量的蛋白樣本，很難獲得該樣本高分辨率的雙向電泳圖像[4]。理想的蛋白提取方法應能夠將所有的蛋白質均勻溶解，同時將對蛋白質分離過程產(chǎn)生影響的其他化合物質（核酸類、脂類、多糖多酚）消除。目前，無一種通用的方法能夠制備出完美的蛋白質樣品，每一種植物樣本都需要一種相對理想的提取方法[5]。

經(jīng)過研究者長期的探索，發(fā)現(xiàn)了多種植物蛋白質提取的方法，為植物蛋白質組學研究提供了試驗基礎[4，6-7]。目前植物全蛋白的提取主要有3種方法：TCA/丙酮法、酚提法以及TCA/酚提結合法。

TCA/丙酮法是蛋白質提取方法中相對簡單的一種。這種植物全蛋白的提取方法已成功應用于多種植物組織中[8-9]，包括玉米[10-11]和木本植物[12]。但該方法對一些成熟的果實、橄欖葉等，無法制備出較好的蛋白樣品。此外，該方法無法完全溶解組織樣品中的蛋白質[13]。

酚提法的研究可追溯于20世紀50年代，已成功應用于多種植物組織蛋白提取中[14-15]，尤其是植物果實中[16]。酚提法較TCA/丙酮法在去除蛋白質干擾混合物有更好的效果[4]。但由于酚提法的提取液中缺少去污劑（如SDS），造成該方法提取的某些蛋白質數(shù)量較少，達不到雙向電泳分析的數(shù)量級。此外，對于像棉花纖維、植物根系以及橄欖葉，酚提法也無法很好地去除干擾混合物[17-18]。

TCA/酚提結合法是將上述2種方法結合，能夠較為有效地提取植物全蛋白[19]。TCA/酚提結合法也在植物蛋白提取試驗中得到驗證，研究者通過該方法提取了竹類葉片、橄欖老葉以及紅樹葉片的蛋白質[19]。但TCA/酚提結合法操作步驟過于繁瑣，較費時，會造成部分蛋白的流失。

福建柏[Fokienia hodginsii（Dunn）Henry et Thomas]為福建鄉(xiāng)土樹種，俗稱建柏，是裸子植物門柏科綱福建柏屬的單一種植物，與銀杏、鵝掌楸等同為孑遺樹種，同時又是我國珍貴野生瀕危物種，被列為國家二級保護樹種[20]。福建柏在福建以外的地域生長十分緩慢，且幼苗期生長容易遭受病蟲害，危及福建柏的成材率與使用價值。不同蛋白質的相互作用對于植物病蟲害的防御具有重要意義[21]。雙向電泳技術與質譜技術的結合，是目前蛋白質組學研究的重要方向。研究者已發(fā)現(xiàn)了多種植物蛋白的提取方法，但對于福建柏植物蛋白提取及其蛋白組學研究少見報道。為了探索適合福建柏全蛋白提取的方法，使福建柏蛋白質雙向電泳的圖譜分辨率更加清晰，筆者對3種提取方法進行了比較，研究雙向電泳中凝膠圖譜上的差異，篩選出適合福建柏植物蛋白的提取方法及雙向電泳體系。

1 材料與方法

1.1 材料

福建柏由福建農(nóng)林大學工業(yè)原料林研究所提供。福建柏組織采用頂部的嫩芽葉，剪取后立即用液態(tài)N2速凍存儲在-80 ℃冰箱中。

1.2 試劑及儀器

硫脲、碘乙酰胺（IAA）、二硫蘇糖醇（DTT）、載體兩性電解質、17 cm pH 3～10預制IPG干膠條（BIO-RAD，USA）、礦物油；過硫酸銨（AP）、低熔點瓊脂糖、尿素（urea）、N，N，N′，N′-四甲基乙二胺（TEMED）、Tris-base堿；十二烷基硫酸鈉（SDS）、牛血清白蛋白（BSA）、標準蛋白Marker、考馬斯亮藍R-250（CBB R-250）、交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮（PVPP）、飽和酚；乙酸、乙醇、甲醇、甲醛、碳酸鈉、硝酸銀、硫代硫酸鈉、三氯乙酸（TCA）、甘油。

Eppendorf Premium U570超低溫冰箱、美國伯樂PROTEAN i12TMIEF System等電聚焦儀和PROTEAN II xi cell電泳儀、LABO GENE SCAN SPEED離心機、Thermo MULTISKAN MK3酶標測定儀、UMAX Power Look 2100XL凝膠掃描儀。

1.3 蛋白樣品的制備

1.3.1 TCA/丙酮法。參照Isaacson等[9]的方法。取0.2 g福建柏葉片去掉木質化枝用液氮研磨，加入1.5 mL TCA/丙酮溶液（含質量分數(shù)10% TCA和體積分數(shù)007%β-巰基乙醇），置于-20 ℃沉淀過夜，于4 ℃、12 500 r/min離心15 min，棄上清，沉淀用4倍體積80% 丙酮（含體積分數(shù)007%β-巰基乙醇）清洗，于-20 ℃靜置15 min后于4 ℃、12 500 r/min離心15 min，棄上清，重復上述步驟4次，最后沉淀即為全蛋白。得到的沉淀用真空干燥器干燥后加入蛋白裂解液水解，裂解后保存于-80 ℃冰箱中，用Bradford法測定蛋白質的含量[22]，并進行雙向電泳。

1.3.2

酚提法。參照Wu 等[13]的方法。取0.2 g福建柏葉片去掉木質化枝用液氮研磨，加入0.8 mL蛋白提取液（0.9 mol/L蔗糖、體積分數(shù)5% β-巰基乙醇、0.07 mol/L SDS、體積分數(shù)7%的1.5 mol/L Tris-HCl pH 8.8）及相同體積Tris-飽和酚，于恒溫搖床4 ℃振蕩30 min后于4 ℃、12 500 r/min離心15 min；小心吸取上層酚相，再加入酚相等體積的提取液；于恒溫搖床4 ℃振蕩30 min后于4 ℃、12 500 r/min離心15 min，重復此步驟2次；最后向酚相中加入5倍體積0.1 mol/L的甲醇醋酸銨溶液（0.1 mol/L醋酸銨溶于甲醇溶液），置于-20 ℃沉淀過夜；于4 ℃、12 500 r/min離心15 min；棄上清，加入4倍體積的預冷甲醇清洗沉淀，渦旋混勻后于4 ℃、12 500 r/min離心10 min。小心吸取上清液并丟棄，重復甲醇清洗步驟3次；最后用丙酮代替甲醇重復清洗步驟2次，所得沉淀用真空干燥器干燥后加入蛋白裂解液水解，裂解后保存于-80 ℃冰箱中，用Bradford法測定蛋白質含量[22]，并進行雙向電泳。

1.3.3

TCA/酚提結合法。參照TCA/丙酮與Tris-飽和酚結合法法并略有修改[18]。操作流程見圖1。操作步驟：取福建柏葉片0.2 g，剪取嫩葉嫩枝，加入適量PVPP后液氮研磨成粉；福建柏粉末轉入2 mL離心管中并加滿10%TCA丙酮提取液（含體積分數(shù)0.07%β-巰基乙醇和質量分數(shù)10% TCA），渦旋混勻后于4 ℃、12 500 r/min離心6 min，棄上清；在離心管中加滿0.1 mol/L甲醇醋酸銨溶液（0.1 mol/L醋酸銨溶于甲醇溶液），渦旋混勻后4 ℃、12 500 r/min離心，棄上清；所得沉淀用80%丙酮清洗，渦旋混勻后4 ℃、12 500 r/min離心并丟棄上清液；置于通風櫥中自然風干棄除殘存的丙酮；在沉淀中加入0.8 mL Tris-飽和酚及0.8 mL SDS蛋白提取液（0.9 mol/L蔗糖、體積分數(shù)5%β-巰基乙醇、0.07 mol/L SDS、體積分數(shù)7%的1.5 mol/L Tris-HCl pH 8.8），渦旋振蕩混勻后室溫靜置10 min，于4 ℃、12 500 r/min離心；將上層酚相轉移至新的離心管；在離心管中加入5倍體積0.1 mol/L甲醇醋酸銨溶液，于-20 ℃中靜置沉淀2 h以上，于4 ℃、12 500 r/min離心6 min，棄上清；所得沉淀用預冷甲醇和80%丙酮分別清洗1次，每次清洗均渦旋混勻并于4 ℃、12 500 r/min離心，所得沉淀用預冷甲醇和80%丙酮分別清洗1次，并按相同參數(shù)離心，最后沉淀即為福建柏葉片全蛋白；沉淀用真空干燥器干燥后加入蛋白裂解液水解，裂解后保存于-80 ℃冰箱中，用Bradford法測定蛋白質含量[22]，并進行雙向電泳。

1.4 全蛋白樣品SDS-PAGE電泳

垂直電泳儀采用美國伯樂公司的PROTEAN II xi cell電泳儀，分析不同方法提取的福建柏葉片全蛋白條帶的分布差異，丙烯酰胺凝膠為7 cm×7 cm，梳孔厚1 mm，12%分離膠，6%濃縮膠。制備4塊丙烯酰胺凝膠用來重復對比。取超低溫冰箱中儲存的全蛋白溶液加入等體積上樣緩沖液（含體積分數(shù)20%0.5 mol/L Tris-HCl pH 6.8，體積分數(shù)40%的10%SDS，體積分數(shù)20%甘油，體積分數(shù)5%的1%溴酚藍，0.1 mol/L DTT），渦旋混勻后沸水浴4 min，結束后室溫冷卻加樣；蛋白樣品上樣體積10 μL，標準Marker上樣10 μL，電泳參數(shù)設置10 mA/膠。凝膠電泳結束后采用考馬斯亮藍R-250進行染色[23]。脫色后用UMAX Power Look 2100XL凝膠掃描儀進行掃描。

1.5 雙向電泳

參照BIO-RAD公司2-DE實驗指南手冊進行，采用美國伯樂公司17 cm（pH 3～10）IPG膠條，上樣量與上樣體積分別為80 μg和300 μL。設置2個重復，取6根IPG膠條進行被動水化：樣品線性加入水化盤中，不要產(chǎn)生任何氣泡，將膠條膠面朝下置于樣品上，使膠條與樣品充分接觸，再在膠面上覆蓋礦物油，置于水平桌面上進行水化，水化時間24 h。等電聚焦（IEF）使用美國伯樂公司PROTEAN i12TMIEF System等電聚焦儀，等電聚焦參數(shù)：250 V（30 min）線性，1 000 V（1 h）快速，10 000 V（5 h）升壓，10 000 V（伏時數(shù)60 000 Vh），500 V保持。

IPG膠條在等電聚焦完成后，一個重復組置于-20 ℃凍存，另一組即刻進行膠條平衡。第1次平衡液（6 mol/L尿素，質量分數(shù)2%十二烷基硫酸鈉SDS，體積分數(shù)20%甘油，0.05 mol/L的Tris-HCl pH 8.8，質量分數(shù)2%DTT），第2次平衡液（6 mol/L尿素，質量分數(shù)2%十二烷基硫酸鈉SDS，體積分數(shù)20%甘油，0.05 mol/L Tris-HCl pH 8.8，質量分數(shù)25%碘乙酰胺），每次平衡均需搖床振蕩不超過15 min，并吸干平衡液。2次平衡完成后進行垂直電泳，膠濃度為12%，起始用低電流5 mA/膠，待樣品完全走出IPG膠條，濃縮成一條線后，再加大電流25 mA/膠，待指示劑到達凝膠底部結束電泳。采用改良的銀染法[24]對凝膠進行染色。

顯色后的凝膠用凝膠掃描儀掃描圖像，分辨率設為1 000 dpi，保存格式為TIF；用PDQUEST 8.0.1 software凝膠圖像軟件對圖像進行分析。

2 結果與分析

2.1 3種蛋白提取方法凝膠電泳結果

將3個福建柏全蛋白進行SDS-PAGE垂直凝膠電泳分析，結果顯示（圖2），3種提取方法（A、B、C）間的蛋白條帶有明顯差異，表明不同提取方法對福建柏全蛋白制備的結果不同；酚提法的蛋白條帶顏色明顯

區(qū)別于其他2種方法的條帶，表明在上樣量相同的情況下，酚提法蛋白質缺失最少，且在26 ku和60 ku附近有2條明顯的高豐度蛋白條帶；而TCA/丙酮法和TCA/酚提 結合法較酚提法的蛋白條帶明顯偏少，且無集中的高豐度蛋

白帶，其中，TCA/丙酮法的條帶最少，顏色最淺，無明顯的

高豐度蛋白。總體表現(xiàn)為酚提法>TCA/酚提結合法>TCA/丙酮法。

對3種方法制備的福建柏全蛋白進行2-DE雙向電泳分析，凝膠掃描結果見圖3，用軟件分析后得到的蛋白點數(shù)明顯不同。TCA/丙酮法獲得285個蛋白點，蛋白質無堆積現(xiàn)象，主要集中在中性端，酸性端與堿性端的蛋白質損失嚴重（圖3A）；

酚提法得到1 226個蛋白點，較其他2種方法分離的蛋白點更多，但在中性端的蛋白點有輕微的堆積現(xiàn)象和豎向條紋（圖3B）；

TCA/酚提結合法得到813個蛋白點，分離效果較好，得到的蛋白點較清晰且規(guī)則，且無明顯的蛋白點堆積，但存在輕微的拖尾現(xiàn)象（圖3C）。因此，與TCA/丙酮法相比，酚提取及TCA/酚提結合法更適合福建柏全蛋白的提取。

2.2 3種提取方法的比較

由表1可知，在3種提取方法中，酚提法作為適中的提取方法，操作步驟較結合法更為簡潔，不會造成大量蛋白質流失；且酚提法較TCA/丙酮法更容易獲得較多的溶解蛋白質。

3 結論與討論

植物蛋白質提取方法較多，不同植物、不同植物器官以及組織的化學成分不同，所以針對特定植物的最佳蛋白質提取方法也有區(qū)別，根據(jù)試驗材料以及試驗設備的差異，需要采用不同的制備方法[2，6，16]。該研究通過對福建柏3種蛋白提取方法得到的2-DE雙向電泳圖譜進行分 析，以期篩選出適合福建柏葉片全蛋白的提取方法。根據(jù)福建柏蛋白提取結果可以看出，與TCA/丙酮法相比，酚提法和TCA/酚提結合法能夠獲得較好的雙向電泳結果，獲得的蛋白點多、清晰，且雜質更少，重復性更高，便于后續(xù)的質譜分析。

從雙向電泳凝膠可以看出，TCA/丙酮法得到的蛋白點明顯少于酚提法和TCA/酚提結合法，可能是由于較多未知蛋白質無法溶解及鹽離子的影響，使較多的蛋白質流失及等電聚焦IEF的效果不理想。

酚提取法有相對較高的凈化力，能夠減少蛋白質分子之間的相互作用。該試驗采用2種酚提方法，這2種方法都提高了蛋白質的收集程度，盡可能減少福建柏蛋白質的流失，在凝膠結果中明顯優(yōu)于TCA/丙酮法；同時，在2種酚提法的酚相中，蛋白質通過甲醇醋酸銨溶液過夜沉淀后，多次重復利用丙酮及甲醇清洗沉淀，可以去除色素以及銨離子等TCA/丙酮法無法去除的雜質。酚提法采用pH 8.8的Tris-HCl，較高的pH能夠抑制蛋白酶的分解作用，且能夠電離酚類化合物，從而減少H+和蛋白質的結合，加速蛋白質的溶解。通過對凝膠分離效果的比較，傳統(tǒng)的酚提法蛋白點數(shù)多于TCA/酚提結合法、TCA/丙酮法，可能是由于結合法的操作步驟繁瑣，操過過程中造成部分蛋白質流失。而在中性端有輕微的蛋白質堆積，可能是在等電聚焦除鹽過程中鹽離子的影響造成的。針對福建柏蛋白組學研究，福建柏全蛋白提取的最優(yōu)方法為酚提取方法。

由于裸子植物的葉片質地較硬，研磨過程會消耗較長時間，如果未保持低溫可能造成蛋白的降解和流失。在磨樣過程中加入適量的PVPP，可以除去大量的色素、酚類等物質，并通過多次的丙酮、甲醇清洗去除一些鹽離子的影響。

該試驗提供了3種福建柏全蛋白的制備方法，對這3種方法提取的全蛋白進行SDS-PAGE電泳條帶分析和2-DE，并對蛋白質分離情況進行對比。結果發(fā)現(xiàn)，傳統(tǒng)的酚提法得到的福建柏蛋白點最多，分離效果較好，其次是TCA/酚提結合法，最后是TCA/丙酮法。因此，該研究認為酚提法較為適宜福建柏全蛋白的制備，且明顯優(yōu)于TCA/酚提結合法。

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