Box睟ehnken優化醇酶法提取野山杏仁油工藝及脂肪酸分析

郝文杰　黎剛剛　周亞瓊　楊俊蘭　姚健　張繼

摘要 [目的]優化野山杏仁油提取工藝并對其成分進行分析。[方法]利用有機溶劑乙醇作為破乳劑輔助水酶法提取野山杏仁油，在單因素試驗的基礎上選擇總酶添加量、乙醇濃度、料液比、酶解時間為主要因素，野山杏仁油的提油率為響應值，通過響應面法優化提取條件。[結果]野山杏仁油最佳提取條件：總酶的添加量為2.00%，乙醇濃度為20.00%，時間為130 min，料液比（g/mL）為1 ∶7，野山杏仁油的提取率為49.86%；并分析了提取的油脂成分，不飽和脂肪酸高達90%以上，其中油酸、亞油酸含量分別為65.68%、24.78%。[結論]乙醇在提取過程中起到了很好的破乳作用，提高了油脂提取率，并且乙醇可回收，解決了水污染問題，可為油脂提取提供參考。

關鍵詞 野山杏；乙醇；水酶法；破乳劑；破乳作用

中圖分類號 S789.5 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2017）01-0108-04

Optimization of Enzymatic Extraction of Almond Oil by BoxBehnken Method and Analysis of Fatty Acids

HAO Wenjie， LI Ganggang， ZHOU Yaqiong， ZHANG Ji* et al

（College of Life Science， Northwest Normal University， Lanzhou， Gansu 730070）

Abstract [Objective] To optimize extraction condition of wild almond oil and analyze its components. [Method] By using aqueous ethanol as demulsifier， on the basis of the single factor experiment， the total amount of enzyme， the concentration of ethanol， the ratio of material to liquid and the time of enzymolysis were selected as the factors. The extraction rate of wild almond oil was the response value， and the extraction condition was optimized by response surface method. [Result] The best extraction condition of the wild almond oil was as follows： total enzyme was 2.00%， ethanol concentration was 20.00%， time was 130 min， the ratio of material to liquid（g/mL） was 1 ∶7， the extraction rate of the wild almond oil was 49.86%；The contents of oleic acid and linoleic acid were 65.68% and 24.78%， respectively， and the content of unsaturated fatty acid was more than 90%. [Conclusion] Ethanol played a good demulsification in the extraction process and improved the extraction rate of oil. And ethanol could be recovered to solve the problem of water pollution， which can provide reference for oil extraction.

Key words Wild apricot；Ethanol；Water enzymatic method；Demulsifier；Demulsification effect

苦杏仁是薔薇科杏屬植物山杏成熟果實帶苦味的種子或種仁，在我國主要產于遼寧、內蒙古、北京、河北、山西、陜西、新疆等北方干旱和半干旱地區，資源十分豐富[1-2]。在植物油的提取過程時，形成乳狀液造成乳化現象的原因是由于油料中蛋白質存在，使提油率降低。水酶法是一種新興的油脂提取工藝，具有無溶劑殘留、油的提取率高、能耗低等優點[3-4]。一般提取溫度在70 ℃以下，可以得到高品質的油脂和蛋白，但是會形成不同程度的乳狀液。為了提高油脂提取率，目前已有的破乳方法有離心破乳、加熱破乳、冷凍解凍破乳、微波輔助破乳、超聲輔助破乳等[5-8]。但是大部分的破乳工藝都增加了更加繁瑣的工藝步驟，不利于普遍應用。殷振雄等[9]采用無機鹽破乳，取得了很好的破乳效果，但無機鹽無法回收從而造成水資源的浪費。李強等[10]用乙醇作為破乳劑首次在油茶籽油水相提取中應用，目前在提油方面尚鮮有其他報道。筆者將破乳劑乙醇和復合酶聯用，以此得到一種新型綠色無污染的提油工藝，并對所提取油的成分進行分析。

1 材料與方法

1.1 材料

原料：野山杏，產自遼寧省葫蘆島市。

主要試劑：石油醚（沸程60～90 ℃），天津市富宇精細化工有限公司；異辛烷（色譜純），天津市化學試劑廠；甲醇（分析純）、乙醇（分析純），天津市凱信化學工業有限公司；纖維素酶，濟寧和美生物工程有限公司；木瓜蛋白酶，北京索萊寶科技有限公司。

主要儀器設備：

蘭工牌香油磨漿機，河南省蘭考縣孟寨鑄造廠；TDL5M臺式大容量冷凍離心機，長沙湘儀離心機儀器有限公司；HH-S8型電熱恒溫水浴鍋，金壇市杰瑞爾電器有限公司；D2010W攪拌器，上海梅穎浦儀器儀表制造有限公司；氣質聯用儀，美國Thermo公司。

1.2 方法

1.2.1 野山杏仁中粗脂肪含量的測定。

粗脂肪含量根據GB/T14772—2008中方法進行測定。

1.2.2 乙醇水酶法提取工藝。

去皮野山杏仁→粉碎→乙醇溶液浸泡→升溫滅酶→冷卻→加入復合酶→酶提→升溫滅酶→冷卻→高速離心→游離油、乳狀液、水提液、渣。

粉碎：將去皮野山杏仁用高速粉碎機粉碎，粉碎時間為40 s。

乙醇溶液浸泡：將粉碎后的野山杏仁漿料以一定體積分數的乙醇溶液溶解浸泡。

升溫滅酶：為了防止杏仁中的內源脂肪酶在酶解過程中發生反應，需要進行滅酶（升溫到85 ℃，保持10 min），使得物料中的內源脂肪酶失活。

高速離心：將野山杏仁漿料醇溶液以一定轉速離心30 min。

取油：離心后用膠頭滴管吸出上層游離油，加入無水硫酸鈉去水，稱重。計算野山杏仁油的提取率（%）。

提取率（%）= 提取野山杏仁油的質量 野山杏仁漿料的質量×漿料含油量 ×100%

1.2.3 單因素試驗。

分別對果膠酶、木瓜蛋白酶、纖維素酶、淀粉酶進行試驗，選取效果較理想的酶，對選取的酶進行復合酶的配比，然后分別對總酶添加量、酶解pH、溫度、乙醇濃度、料液比、提取時間進行單因素試驗。

1.2.4 提取條件的優化設計。

在單因素試驗的基礎上，依據響應面設計原理，對影響野山杏仁油提取率的因素進行選擇，即總酶添加量、乙醇濃度、料液比（g ∶mL）、酶解時間，進行4因素3水平的響應面試驗，利用響應值確定最佳提取條件。試驗因素與水平設計見表1。

1.3 野山杏仁油的脂肪酸分析

采用GB/T17376—2008中的酯交換法分析野山杏仁油的脂肪酸，其GCMS條件：RTX-5MS型彈性石英毛細管（30 m×0.25 mm×0.25 μm），載氣He，流速1.0 mL/min：分流比為50 ∶1，傳輸線溫度為250 ℃，進樣口溫度為250 ℃。程序升溫：初始溫度150 ℃保持3 min；以5 ℃/min從150 ℃升高到220 ℃，保持1 min；以1 ℃/min從220 ℃升高到230 ℃，保持1 min；以5 ℃/min從230 ℃升高至250 ℃，電子能量70 eV，掃描范圍50～650 amu。

2 結果與分析

2.1 野山杏仁的粗脂肪含量

經試驗測得，供試野山杏仁的含油量為50.67%。

2.2 單因素試驗

2.2.1 不同酶種類對野山杏仁油提取率的影響。從圖1可以看出，對野山杏仁油提取率效果較好的酶是木瓜蛋白酶和纖維素酶，是因為油滴被包裹在蛋白質及其纖維結構中，蛋白酶和纖維素酶可以分解蛋白和纖維，使油滴釋放，從而提高了出油率。

2.2.2 不同酶配比對野山杏仁油提取率的影響。

從圖2可以看出，隨著木瓜蛋白酶比例的增加，野山杏仁油提取率增加，當比例達到3 ∶1時，提取率增加不明顯，考慮到成本問題，選擇酶配比（木瓜蛋白酶 ∶纖維素酶）3 ∶1較為合適。

2.2.3 總酶添加量對野山杏仁油提取率的影響。

從圖3可知，總酶添加量達到2.0%后，野山杏仁油提取率趨于平緩，再增加總酶添加量，提取率增加不明顯，故總酶添加量選擇2.0%。

2.2.4 不同pH對野山杏仁油提取率的影響。從圖4可知，當體系pH在7.0時對野山杏仁油的提取效果最好，是由于在此pH下，木瓜蛋白酶和纖維素酶的活性極好，當pH升高或降低，提取率均下降，是由于其酶的活性下降，故選擇pH為7.0。

2.2.5 不同提取溫度對野山杏仁油提取率的影響。

從圖5可知，當提取溫度在40 ℃之前，野山杏仁油提取率隨提取溫度的升高而增加，在40 ℃之后提取率隨提取溫度的升高而開始緩慢下降。因為酶在最適溫度下活性能達到較好的狀態，當溫度升高會使酶活性下降，提取率下降。

2.2.6 不同乙醇濃度對野山杏仁油提取率的影響。

從圖6可知，當乙醇濃度達到20%時，對野山杏仁油的提取效果最好，隨后出現下降趨勢。可能是由于乙醇是表面活性劑，可以降低表面張力，使乳化效果減弱，當濃度持續增大后，游離的蛋白又與油滴結合成乳狀液，使得提取率下降。

2.2.7 不同料液比對野山杏仁油提取率的影響。

從圖7可知，隨著料液比中溶劑用量的增加，野山杏仁油提取率隨之增加，當料液比達到1 ∶7之后，提取率下降。因此，料液比選擇1 ∶7效果較好。

2.2.8 不同酶解時間對野山杏仁油提取率的影響。

從圖8可知，隨著提取時間的增加，野山杏仁油提取率增加，當提取時間過長后，其提取的油脂又與其蛋白結合成乳狀液，故選擇120 min為最佳提取時間。

2.3 醇酶法提取野山杏仁油的條件優化

在單因素試驗的基礎上，選取酶的添加量（X1）、乙醇濃度（X2）、料液比（X3）、酶解時間（X4）為主要因素，以野山杏仁油提取率為響應值，進行響應面優化分析。試驗方案及結果見表2。

從此看出，回歸方程模型F值為13.75，P<0.000 1， 說明回歸方程模型極顯著；方程失擬項P值（0.107 8） 遠大于0.05，表現為不顯著，說明該方程與試驗數據擬合度良好。其中X1、X21、X22、X23、X24對野山杏仁油的提取率極顯著；在4個單因素試驗中，顯著性大小為X1>X4>X2>X3，即對野山杏仁油提取率的影響程度大小依次為總酶添加量、酶解時間、乙醇濃度、料液比。

二維空間的等高線圖是橢圓形，說明這2個因素對提取率的相互作用明顯，如果是圓形，則說明這2個因素對提取率的相互作用不明顯[11]。從圖9可以看出，乙醇濃度和時間對野山杏仁油的提取率有顯著的交互作用。

2.4 驗證試驗

通過分析建立以提取率為目標值，以酶的添加量、乙醇濃度、酶解時間、料液比為因素的模型。通過對回歸方程的優化計算得到了最佳的提取條件：酶的添加量為2.17%，乙醇濃度19.96%，時間129.85 min，料液比為1 ∶7，提取率可以達到52.29%。考慮實際試驗的操作性，將條件優化為酶的添加量2.00%，乙醇濃度20.00%，酶解時間130 min，料液比為1 ∶7進行試驗，結果表明，此優化條件下野山杏仁油的提取率為49.86%，與預測值接近，模型精準度為95.35%。

2.5 野山杏仁油的脂肪酸組成及其含量

從圖10和表3中可以看出，乙醇破乳輔助復合酶提取的野山杏仁油的不飽和脂肪酸含量高達90%以上，其中油酸65.68%，亞油酸2478%，其成分與索氏提取法得到的相近，具有良好的應用價值。

3 結論與討論

該試驗通過響應面對醇酶法提取野山杏仁油的工藝進行了優化，確定了最優提取條件下的提取率可達49.86%；同時分析了提取的油脂成分，不飽和脂肪酸高達90%以上，營養成分未被破壞，具有較好的營養價值。

乙醇在提取過程中起到了很好的破乳作用，提高了油脂提取率；并且乙醇可以回收，解決了水污染問題。說明低濃

度的乙醇提取油脂性植物油質中起到很好的破乳效果，為今后油脂的安全高效提取提供了參考依據。

參考文獻

[1] 王利兵.山杏開發與利用研究進展[J].浙江林業科技，2008，28（6）：76-80.

[2] 楊曉宇，陳錦屏.杏仁的營養保健功能及其在食品工業中的應用[J].食品科學，2005，26（9）：629-631.

[3] 陳晶，許時嬰.亞麻籽油的水酶法提取工藝的研究[J].食品工業科技，2007，28（2）：151-153.

[4] 郭玉寶，裘愛泳，薛正蓮，等.鹽效應對油茶籽油水相萃取的影響[J].中國油脂，2010，35（9）：22-24.

[5] 李招娣，鄧紅，范雪層，等.冷榨文冠果籽油的氧化穩定性研究[J].中國油脂，2008，33（9）：33-35.

[6] VILKHU K，MAWSON R，SIMONS L，et al.Applications and opportunities for ultrasound assisted extraction in the food industry：A review[J].Innov Food Sci Emerg Technol，2008，9（2）：161- 169.

[7] 馬嬌，陶海騰，徐同成，等.響應面法優化超聲波輔助水酶法提取小麥胚芽油的研究[J].中國糧油學報，2013，28（12）：57-62.

[8] ZHANG S B，WANG Z，XU S Y.Optimization of the aqueous enzymatic extraction of rapeseed oil and protein hydrolysis[J].J Am Oil Chem Soc，2007，84（1）：97-105.

[9] 殷振雄，梁俊玉，宋珅，等.熱鹽水法提取文冠果油及其脂肪酸分析[J].食品與發酵工業，2013，39（8）：233-237.

[10] 李強，楊瑞金，張文斌，等.乙醇對油茶籽油水相提取的影響[J].中國油脂， 2012，37（3）：6-9.

[11] KARUPPAIYA M， SASIKUMAR E， VIRUTHAGIRI T， et al.Optimization of process variables using response surface methodology（RSM）for ethanol production from cashew apple juice by Saccharomyces cerevisiae[J].Asian journal of food and agroindustry，2010，3（4）：462-473.