快速超廣譜β-內酰胺酶篩查在尿路感染中的應用價值研究

王憲靈 王縛鯤 趙會海 張盼 賈克然 張海譜

·論著·

快速超廣譜β-內酰胺酶篩查在尿路感染中的應用價值研究

王憲靈 王縛鯤 趙會海 張盼 賈克然 張海譜

目的 探討快速超廣譜β-內酰胺酶(ESBLs)篩查實驗在住院尿路感染(urinary tract infection，UTI)患者中的應用價值，為及時有效治療UTI提供依據。方法 快速ESBLs篩查實驗采用液體培養基添加頭孢噻肟比濁法測定。UTI患者送檢中段尿培養標本1 160份，離心鏡檢分為可疑革蘭陰性桿菌感染組(502例)，可疑革蘭陽性球菌感染組(103例)，可疑念珠菌感染組(15例)，可疑混合感染組(85例)，可疑陰性組(431例)。采用ESBLs快速篩查方法和ESBLs確認實驗方法分別對其中的可疑革蘭陰性桿菌感染組、可疑混合感染組和可疑陰性組進行檢測，比較兩種方法的差異。結果 在可疑革蘭陰性桿菌感染組、可疑混合感染組和可疑陰性組3組，ESBLs確認試驗共檢測到產ESBLs菌株陽性標本346例(33.21%)，快速ESBLs篩查試驗共檢測到產ESBLs菌株陽性標本386例(37.04%)，兩者陽性率比較差異無統計學意義(χ2=3.369，P=0.066)。在可疑革蘭陰性桿菌感染組，兩者的符合率為84.03%，快速ESBLs篩查試驗的假陽性率為23.91%，假陰性率為9.80%。在可疑混合感染組，兩者的符合率為70.58%，快速ESBLs篩查試驗的假陽性率為54.05%，假陰性率為10.42%。在可疑陰性組，兩者的符合率為99.77%。結論 快速ESBLs篩查實驗方法簡單、宜行，并且快速，可以用來作為尿路感染患者尿培養標本細菌藥敏實驗的初步結果指導UTI治療。

尿路感染；超廣譜β-內酰胺酶；快速；篩查

尿路感染(urinary tract infection，UTI)是臨床常見的感染性疾病之一，治療方面多種抗生素均可用于治療UTI。在引起UTI的致病菌中，以革蘭陰性桿菌為主，其中產超廣譜β-內酰胺酶(ESBLs)耐藥菌株占所培養出的革蘭陰性桿菌的60%以上[1-3]。針對UTI推薦的經驗性治療抗感染藥物，一般需要滿足耐藥率低于10%的要求，但衛生部細菌耐藥監測結果顯示：除呋喃妥因外，尚無其他能滿足廣譜需要的單種口服抗生素用于治療UTI。由于傳統的培養和藥敏方法耗時較長，不能及時報告細菌耐藥結果，一方面造成無效治療，另一方面增加患者負擔，造成疾病遷延不愈，因此快速準確鑒別出產超廣譜β-ESBLs致病菌在UTI治療中非常重要。本研究探討快速超廣譜β-ESBLs篩查實驗在UTI中的應用價值，為及時有效治療UTI提供依據。

1 材料與方法

1.1 標本來源 收集2013年1月至2013年12月我院住院疑似UTI患者送檢中段尿培養標本1 160份。所有標本為晨起留取的中段尿，2 h內送檢。患者中男109例，女1 051例；年齡1～96歲，平均(56.2±1.5)歲。

1.2 儀器與試劑 惠州市陽光生物科技公司SS-1000B型細菌測定/藥敏分析儀及配套檢測板；DNM-9602型酶標儀為北京普朗新技術公司產品；抗菌藥敏紙片、血基礎培養基、M-H培養基、肉湯培養基為英國Oxoid公司產品；ESBLs篩查培養基為肉湯培養基中添加頭孢噻肟至終濃度2.0 μg/ml。

1.3 方法

1.3.1 標本篩選和預處理:取中段尿標本5 ml加入無菌離心管中，1 000 g/min離心1 min，上清轉移至另一無菌離心管中，5 000 g/min離心20 min，吸棄上清留底部約0.2 ml混勻，取50 μl滴加在玻片上自然干燥，固定后染色鏡檢，鏡檢僅發現革蘭陰性桿菌為可疑革蘭陰性桿菌感染組，鏡檢僅發現革蘭陽性球菌做為可疑革蘭陽性球菌感染組，鏡檢僅發現念珠菌做為可疑念珠菌感染組，鏡檢發現兩種以上細菌做為可疑混合感染組，鏡檢未發現細菌做為可疑陰性組，然后再進行下一步實驗。

1.3.2 快速ESBLs篩查試驗:取可疑革蘭陰性桿菌感染組、可疑混合感染組、和可疑陰性組離心后尿標本50 μl加入到950 μl快速ESBLs篩查培養基中混勻，取200 μl加入到96孔無菌培養板中，每個標本均做3個復孔。將培養板放入酶標儀中，輕振板1次，檢測波長600 nm吸光度值。然后將培養板放入35℃溫箱中保濕培養4 h，取出在酶標儀中檢測波長600 nm吸光度值。結果判定：每個樣本3個復孔吸光度值明顯改變，≥2倍初始值判為ESBLs陽性。

1.3.3 常規尿標本的細菌培養、鑒定和藥敏:中段尿標本常規培養按臨床檢驗操作規程[4]方法進行，利用陽光生物SS-1000B型細菌測定/藥敏分析儀和微量生化管鑒定細菌到種。藥敏試驗采用陽光生物SS-1000B型細菌測定/藥敏分析儀測定。質控菌株為大腸埃希菌ATCC25922購自中國工業微生物菌種保藏中心。

1.3.4 ESBLs確認試驗:采用美國臨床實驗室標準化協會推薦的ESBLs表型確證試驗，按照常規 標準紙片擴散法進行操作。方法為將常規培養的待檢菌株用0.9%氯化鈉溶液配成0.5麥氏單位菌液，以3個不同角度均應涂布于MH瓊脂板上，貼上每片含頭孢他啶(30 μg)、頭孢他啶/克拉維酸(30 μg/10 μg)、頭孢噻肟(30 μg)、頭孢噻肟/克拉維酸(30 μg/10 μg)的藥敏紙片，當復合物藥敏紙片抑菌環直徑大于或等于單一藥敏紙片5 mm，即判定為ESBLs陽性。

2 結果

2.1 標本篩選與分組情況 經離心涂片鏡檢的方法篩選，1 160份標本中526份(45.34%)為可疑革蘭陰性桿菌感染，103份(8.88%)為可疑革蘭陽性球菌感染，85份(7.33%)為可疑混合感染，15份(1.29%)為可疑念珠菌感染，其他431份(37.16%)為可疑陰性。

2.2 常規尿標本細菌培養和鑒定結果 1 160份尿標本共檢測到細菌768株，其中大腸埃希菌422株(54.95%)，為UTI的主要致病菌。見表1。

表1 768株細菌構成比

2.3 ESBLs確認試驗和快速篩查試驗在不同組中檢測情況 在可疑革蘭陰性桿菌感染組、可疑混合感染組和可疑陰性組3組中，確認試驗共檢測到產ESBLs菌株陽性標本346例(33.21%)，快速篩查試驗共檢測到產ESBLs菌株陽性標本386例(37.04%)，兩者陽性率比較差異無統計學意義(χ2=3.369，P=0.066)。見表2。

表2 不同組別樣本中產ESBLs菌株的檢測情況 例(%)

注:與ESBLs確認試驗比較,*P<0.05

2.4 ESBLs確認試驗和快速ESBLs篩查試驗的一致性 在可疑革蘭陰性桿菌感染組，可疑混合感染組和可疑陰性組3組共1 042例樣本中，兩種方法均為陽性的標本例數為311例(29.85%)，均為陰性的樣本例數為621例(59.60%)，兩者總的符合率為89.45%；在可疑革蘭陰性桿菌感染組，兩者的符合率為84.03%，以ESBLs確認試驗為標準，快速篩查試驗的假陽性率為23.91%，假陰性率為9.80%。在可疑混合感染組，兩者的符合率為70.58%，以ESBLs確認試驗為標準，快速篩查試驗的假陽性率為54.05%，假陰性率為10.42%。在可疑陰性組431例標本中，僅有一例ESBLs確認試驗陽性，快速ESBLs篩查試驗陰性，其他完全符合，符合率為99.77%。見表3、4。

表3 可疑革蘭陰性桿菌感染組產ESBLs菌株檢測情況 例

表4 可疑混合感染組產ESBLs菌株檢測情況 例

3 討論

ESBLs主要是革蘭陰性菌尤其是由腸桿菌科細菌產生的，其編碼基因位于細菌的質粒上，耐藥性可通過質粒在細菌間擴散。ESBLs能夠水解青霉素類、頭孢菌素類和單環β-內酰胺類抗生素，從而使抗生素失效。近年來，隨著廣譜抗菌藥物的廣泛使用，細菌耐藥性尤其是產ESBLs的菌株所致的耐藥性迅速增加[5]，此耐藥菌株不僅在細菌間傳播，而且還能夠在患者間甚至醫院之間互相傳播[6]，給臨床的抗感染治療帶來極大困難。

自從1983年首次分離出ESBLs以來，產ESBLs菌株引起的感染發病率在逐漸提高，在UTI中ESBLs陽性菌株引起的泌尿系感染占分離培養出革蘭陰性桿菌的60%以上[1-3]，因此準確及時的檢測出產ESBLs的耐藥菌株，選擇合適的治療藥物，對UTI的治療非常重要。然而傳統的ESBLs確認實驗首先需要經過細菌培養、分離、鑒定和藥敏過程，需要48 h以上的時間，嚴重影響患者的用藥治療，并增加患者負擔，因此，在UTI治療中，建立快速、準確的檢測產ESBLs菌株的方法有很大的實用價值。國外對檢測產ESBLs菌株的方法進行了許多研究，包括紙片確證實驗、肉湯稀釋法、雙紙片協同法和三維實驗等[7]，但這些方法的共同缺點是都需要分離菌株，用時較長。現在最新的方法是應用多重PCR的方法[8]，雖然準確性較高用時較短，但操作繁瑣對實驗條件要求較高，現在還不能廣泛推廣使用。因此我們以肉湯稀釋法為基礎，建立UTI快速ESBLs篩查試驗。本實驗首先將尿標本低速離心去除引起標本渾濁的尿中沉淀物，然后高速離心最大程度的濃縮細菌，液體培養基使細菌快速增值，4 h 即可進行檢測，原因：(1)實驗證明大多革蘭陰性桿菌在4 h既可檢測到快速增值，而相應的球菌或念珠菌大量增殖需要5 h以上或更長的時間，最大程度避免了干擾；(2)為了患者當天可以拿到初步檢測結果，用來指導臨床用藥。

由于革蘭陽性球菌和念珠菌不產生超廣譜β-內酰胺酶(ESBLs)，所以本研究僅針對可疑單一革蘭陰性桿菌感染、可疑混合感染和可疑陰性組標本。本研究結果表明，結合尿標本離心涂片，快速ESBLs篩查試驗與確認試驗總的符合率為89.45%。可疑革蘭陰性桿菌感染組兩者的符合率為84.03%，引起假陽性的原因主要是由鮑曼不動桿菌和銅綠假單胞菌等的非ESBLs來源的耐藥菌株引起的，假陰性主要是因為患者尿標本中菌量較低或者患者采樣近期應用抗生素等因素引起的。在可疑混合感染組兩者的符合率為70.58%，除了與可疑革蘭陰性桿菌感染組類似的原因，革蘭陽性球菌以及念珠菌的干擾也是一個原因。在可疑陰性組，兩者的符合率高達99.77%，提示快速ESBLs篩查試驗的陰性預測值對無細菌感染的尿標本有很高的準確性。ESBLs篩查試驗目的應該是能夠最大程度的給醫生提供抗生素治療建議，雖然快速ESBLs篩查試驗假陽性較高，但是由于引起假陽性菌株多是耐藥菌株，所以仍具有參考意義；針對假陰性患者，由于主要是因為尿標本中菌量較低引起，這部分患者一般都屬于慢性病患者，而且多經過抗生素治療，可以考慮暫不治療等細菌培養分離確認結果后再進行治療。快速ESBLs篩查試驗雖然有許多不完善，但是對于UTI臨床抗生素治療仍有很大的參考意義。

綜上所述，UTI感染和復發作為一種常見病，細菌培養和藥敏試驗用來指導UTI感染治療存在諸多不足，耗時較長，受細菌生物膜影響體外藥敏試驗敏感抗生素體內無效等。所以如何合理應用抗生素，有效治療UTI，減少復發，臨床實驗室有許多工作要做。快速ESBLs篩查試驗做為一種耐藥菌的初篩實驗，應用有很大的局限性，但對于減少盲目用藥，避免無效治療，減輕患者負擔，避免更多的耐藥菌產生仍具有積極的意義。

1 齊慧敏,呂媛.衛生部全國細菌耐藥監測網2011年女性尿標本來源細菌耐藥監測.中國臨床藥理學雜志,2012,28:899-904.

2 齊慧敏,呂媛,錢霞.衛生部全國細菌耐藥監測網2010年女性尿標本來源細菌耐藥監測.中國臨床藥理學雜志,2011,27:913-918.

3 鄭波,呂媛.衛生部全國細菌耐藥監測網2011年男性尿標本來源細菌耐藥監測.中國臨床藥理學雜志,2012,28:893-898.

4 葉應嫵,王毓三,申子瑜主編.全國臨床檢驗操作規程.第1版.南京:東南大學出版社,2006.743-744.

5 韓松濤,曾德鵬,徐梅,等.產超廣譜β-內酰胺酶大腸埃希菌的耐藥機制研究.檢驗醫學與臨床,2016,13:1638-1640.

6 李丹.產ESBLs菌株的流行現狀及耐藥性分析.中國醫藥科學,2012,13:54-56.

7 孫長貴,陳漢美.超廣譜β-內酰胺酶及其實驗室篩檢.臨床檢驗雜志,2000,18:52-55.

8 Zefiryn C,Katar S,Alicja G,et al.Usability application of multiplex polymerase chain reaction in the diagnosis of microorganisms isolated from urine of patients treated in cancer hospital.Radiol Oncol,2013,47:296-303.

10.3969/j.issn.1002-7386.2017.13.028

050082 石家莊市，中國人民解放軍白求恩國際和平醫院檢驗實驗科

張海譜,050082 石家莊市，中國人民解放軍白求恩國際和平醫院檢驗實驗科;

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2017-01-06)