“桂枝與白芍”藥對不同比例配伍的HPLC指紋圖譜探討

陳永財+錢江輝+王彬輝+沙先誼

[摘要] 目的 建立“桂枝與白芍”藥對不同比例配伍的高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜，探討桂枝與白芍不同比例配伍后化學(xué)成分差異性及其煎出率變化。 方法 采用HPLC法，以Dikma Spursil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）為色譜柱，流動相乙腈-0.1%冰醋酸水洗脫，溫度25℃，進(jìn)樣量10 μL，檢測波長254 nm，流速1 mL/min。對“桂枝與白芍”藥對（1∶1）、（1∶2）、（5∶3）不同比例配伍的HPLC指紋圖譜采用相似度評價軟件（2004A版）分析，并用各藥對共有色譜峰面積與單煎相對應(yīng)色譜峰面積的比值比較分析。 結(jié)果 確定18個共有峰，指認(rèn)其中6個色譜峰，對共有峰歸屬，并進(jìn)行相似度評價。初步確立單味白芍及桂枝白芍（1∶1）、（1∶2）、（5∶3）配伍后白芍中共有峰各成分煎出率依次提高，桂枝白芍（5∶3）時煎出效果最佳；桂枝白芍（5∶3）、（1∶2）配伍肉桂酸煎出率降低，可桂枝白芍（1∶1）配伍后肉桂酸煎出率接近單味桂枝，煎出效果最佳。 結(jié)論 該方法簡單、準(zhǔn)確、快速，重復(fù)性好，能有效地對“桂枝與白芍”藥對的質(zhì)量控制和成分鑒別及配伍理論提供依據(jù)。

[關(guān)鍵詞] 桂枝；白芍；藥對；高效液相色譜；指紋圖譜；成分歸屬

[中圖分類號] R284 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）05（a）-0029-06

Discussion on HPLC fingerprints for the different compatibility proportion Ramulus Cinnamomi and Radix Paeoniae Alba

CHEN Yongcai1 QIAN Jianghui2，3 WANG Binhui4 SHA Xianyi2，3

1.Department of Pharmacy， Wenzhou Hospital of Traditional Chinese Medicine， Zhejiang Provicne， Wenzhou 325000， China； 2.Staff Room of Pharmacy， School of Pharmacy， Fudan University， Shanghai 201203， China； 3.Academy of Integrative Chinese and Western Medicine， Fudan University， Shanghai 201203， China； 4.Department of Pharmacy， Affiliated Hospital of Medical College of Taizhou University， Zhejiang Province， Taizhou 318002， China

[Abstract] Objective The high performance liquid chromatography （HPLC） fingerprints for the different compatibility proportion Ramulus Cinnamomi and Radix Paeoniae Alba was developed to explore the component difference and the changing of solution rate. Methods The HPLC method with Dikma Spursil C18 （250 mm×4.6 mm， 5 μm） column was used， the mobile phase was acetonitrile-0.1% acetic acid solution with gradient elution， the column temperature was 25℃， the inject volume was 10 μL， the detection wavelength was set at 254 nm， the flow rate was 1 mL/min. Similarity evaluation software （2004A edition） was adopted to analyze the HPLC fingerprints of the different compatibility proportion of Ramulus Cinnamomi and Radix Paeoniae Alba at the ratio of 1∶1， 1∶2 and 5∶3， and the common peaks area were compared with the single drug solution. Results 18 common peaks were found and 6 chromatographic peaks were identified. Evaluation of similarity was done for these common peaks. The results showed that the extraction rate of common peaks from Radix Paeoniae Alba increased in the order of 1∶1， 1∶2， 5∶3 for the mixture of Ramulus Cinnamomi and Radix Paeoniae Alba， and reached its highest level at 5∶3. While the extraction rate of cinnamic acid decreased in the order of 5∶3， 1∶2 and reached the lowest level at a ratio of 1∶1， which was equal with the extraction rate of a single Ramulus Cinnamomi. Conclusion The method is simple， reproducible， and accurate， which can be applied to the quality control and provides some compatibility theoretical bases for the drug pair of Ramulus Cinnamomi and Radix Paeoniae Alba.

[Key words] Ramulus Cinnamomi； Radix Paeoniae Alba； Drug pairs； High performance liquid chromatography； Fingerprint； Component attribution

“桂枝與白芍”為典型的相制配伍，源于《傷寒論》之桂枝湯，為臨床常用的調(diào)和營衛(wèi)、溫通止痛藥對[1]。二者伍用桂枝湯（桂枝∶白芍為1∶1，以9～10 g為宜），治太陽中風(fēng)表虛證；桂枝加芍藥湯（桂芍1∶2）治太陽病誤下傷中土虛木乘之腹痛；桂枝加桂湯（桂芍5∶3）治心陽虛弱寒氣凌心之奔豚[2-3]，可見中醫(yī)臨床合理應(yīng)用“桂枝與白芍”藥對關(guān)鍵在于不同劑量配伍[4]。現(xiàn)代研究證明，桂枝中桂皮醛、肉桂酸等成分，白芍中芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷等成分具有明顯的藥理活性[5-8]，藥對功效物質(zhì)基礎(chǔ)不是二味藥疊加，而是二味藥不同成分相互作用形成的共同體，研究不同配比功效物質(zhì)的溶出變化特點，可為闡明現(xiàn)有藥對配伍比例的變化規(guī)律提供依據(jù)[9-11]，可見分析桂枝與白芍不同比例配伍后化學(xué)成分差異性及其煎出率變化尤為關(guān)鍵。

本研究選取單味桂枝、單味白芍、桂枝與白芍分別按（1∶1）、（1∶2）、（5∶3）不同比例配伍為研究對象，對各組水煎液提取物采用高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜研究。通過HPLC指紋圖譜對比分析不同配伍比例間的化學(xué)成分差異性及其煎出率變化，為“桂枝與白芍”藥對質(zhì)量控制和成分鑒別及配伍提供理論依據(jù)[12-14]。

1 儀器與試劑

島津高效液相色譜儀（LC-15C）、分析色譜柱（Dikma Spursil C18 250 mm×4.6mm，5 μm）、分析天平（BT 25S，北京賽多利斯）、天平（BT 210S，北京賽多利斯）、旋渦振蕩儀（XW-80A，海門市其林貝爾儀器制造有限公司）、超聲波清洗器（SK2510HP，上海超導(dǎo)超聲儀器有限公司）。

乙腈（色譜純AS1122-801 Tedia），其余試劑分析純。芍藥苷、桂皮醛對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：110736-201438、110710-201418），兒茶素、沒食子酸、原兒茶酸、沒食子酸甲酯、芍藥苷內(nèi)酯、沒食子酸乙酯、丁香醛、香豆素、肉桂酸、丹皮酚對照品（上海同田制藥，批號：15082731、15033122、15090235、15051322、15010332、15072821、15012321、15072141、15051935、15072836）。桂枝、白芍中藥飲片（浙江華宇中藥飲片有限公司，批號：1503190、1505100），經(jīng)浙江中醫(yī)藥大學(xué)熊耀康教授鑒定桂枝為樟科植物肉桂（Cinnamomμm cassia Presl）的干燥嫩枝，白芍為毛茛科植物芍藥（Paeonia lactiflora Pall）的干燥根。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

島津液相色譜儀（LC-15C），Dikma Spμrsil C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相乙腈（A）-0.1%冰醋酸水（B），梯度洗脫程序見表1[15-17]，柱溫：25℃，檢測波長：254 nm，流速：1 mL/min，進(jìn)樣量：10 μL。

2.2 混合對照品溶液的配制

分別精密稱取芍藥苷、桂皮醛、兒茶素、沒食子酸、原兒茶酸、沒食子酸甲酯、芍藥苷內(nèi)酯、沒食子酸乙酯、丁香醛、香豆素、肉桂酸、丹皮酚12種對照品10 mg，用甲醇配成1 mg/mL母液。取上述各對照品母液200 μL，用甲醇定容至10 mL容量瓶中，配制成混合對照品溶液。

2.3 供試品溶液的配制

2.3.1 不同比例配伍水煎液提取物制備 按桂枝與白芍藥對（1∶1）稱桂枝90 g、白芍90 g，按正交優(yōu)選條件[18]加水量10倍，浸泡60 min，煮沸后微火煎煮60 min，合并2次提取液，過濾，將濾液減壓濃縮并調(diào)整濃度至（1∶6）浸膏備用，精密稱取100 mg浸膏，加50%乙腈水溶液10 mL，旋渦振蕩儀渦旋1 min，超聲5 min，0.45 μm微孔濾膜過濾，按“2.1”項下色譜條件測定。

按桂枝與白芍藥對（1∶2）稱桂枝60 g、白芍120 g；按桂枝與白芍藥對（5∶3）稱桂枝112.5 g、白芍67.5 g，同上述方法分別制備桂枝白芍藥對（1∶2）和桂枝白芍藥對（5∶3）供試品。

2.3.2 桂枝和白芍單味水煎液提取物制備 稱桂枝90 g和單味白芍90 g分別單獨煎煮，按“2.3.1”項下方法制備單味桂枝和單味白芍供試品。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 精密度試驗 取“2.3.1”項下配制桂枝白芍（1∶1）供試液，按“2.1”項下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次。以芍藥苷為參照峰，各主峰相對保留時間RSD值為0.03%～0.56%，相對峰面積為0.31%～1.97%，表明方法精密度良好。

2.4.2 重復(fù)性試驗 取“2.3.1”項下配制桂枝白芍（1∶1）供試液，重復(fù)制備6次，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)行測定。以芍藥苷為參照峰，各主峰相對保留時間RSD值為0.21%～1.02%，相對峰面積為0.81%～2.17%，表明方法重復(fù)性良好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗 取“2.3.1”項下配制桂枝白芍（1∶1）同一供試品液，分別于0、2、4、8、12 h檢測，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)行測定。芍藥苷為參照峰，各主峰相對保留時間RSD值為0.15%～0.92%，相對峰面積為0.71%～2.30%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)基本保持穩(wěn)定。

2.5 桂枝與白芍藥對指紋圖譜建立

2.5.1 共有特征峰的確立 取“2.3.1”項下分別配制桂枝白芍（1∶1）、桂枝白芍（1∶2）和桂枝白芍（5∶3）供試液，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)行測定。將不同藥對指紋圖譜，采用國家藥典委員會“中藥指紋圖譜計算機(jī)輔助相似度評價軟件（2004A版）”分析，時間窗口設(shè)為0.1，經(jīng)多點校正和數(shù)據(jù)匹配，以平均數(shù)法生成指紋圖譜和對照指紋圖譜（圖1）。根據(jù)色譜出峰時間、色譜峰分離度及色譜峰型確定了18個共有特征峰。

2.5.2 桂枝白芍不同比例配伍相似度計算 根據(jù)表2桂枝白芍不同比例配伍相似度可得，相似度最小為0.935且大于0.9，結(jié)果表明建立的指紋圖譜能夠定性考察不同比例配伍桂枝與白芍水煎液。

2.5.3 桂枝白芍不同比例配伍特征峰相對保留時間 桂枝白芍不同比例配伍18個共有峰中芍藥苷出峰時間[（13.6±0.5）min]穩(wěn)定，與其他相鄰峰分離度較好，因此選為參比峰。以芍藥苷出峰時間為1，計算18個共有峰的相對保留時間，結(jié)果表明桂枝白芍不同比例配伍18個共有峰相對保留時間RSD值均小于2%，說明指紋圖譜各成分出峰時間穩(wěn)定。見表3。

2.5.4 桂枝白芍不同比例配伍色譜峰 各組樣品的典型色譜圖如圖2所示。樣品中各成分均能達(dá)到基本分離要求，表明建立的色譜分析方法符合中藥指紋圖譜分析的基本要求。

2.6 HPLC指紋圖譜共有峰的來源認(rèn)定

通過比對單味藥的色譜峰，不同比例配伍桂枝與白芍藥對HPLC指紋圖譜18個共有峰中編號1、2、3、5、6、7、8、9、10、11、12、17號共13個峰均來源于單味藥白芍，編號2、3、5、7、11、13、14、15、16、18號共10個峰來源于單味藥桂枝，其中編號2、3、5、7、11號5個峰為兩味中藥共同產(chǎn)生（圖3）。不同比例配伍桂枝與白芍藥對18個共有峰是桂枝、白芍各自色譜峰的加和，二味藥合煎并未發(fā)現(xiàn)新的色譜峰。

通過混合對準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)色譜圖（圖4）對各樣品指紋圖譜的各峰進(jìn)行定性認(rèn)證，結(jié)果表明編號3、5、9、10、13、16號峰分別為沒食子酸、原兒茶酸、芍藥苷內(nèi)酯、芍藥苷、香豆素、肉桂酸，除沒食子酸（3號峰）和原兒茶酸（5號峰）為桂枝、白芍共有外，其余各峰均是各單味藥所特有的色譜峰。

2.7 桂枝白芍藥對HPLC指紋圖譜定量分析

所有指紋圖譜數(shù)據(jù)經(jīng)過處理，將各樣品中桂枝生藥量換算成一致的量，以桂枝單煎樣品峰面積分別作為參比，將其他各樣品13、14、15、16、18的峰面積（除桂枝白芍共同峰外）與其峰面積相比，計算相對峰面積，結(jié)果見表4。由表4可知，桂枝中各成分配伍后煎出率的變化有以下特點：13#峰（香豆素）、15#峰、16#峰（肉桂酸）煎出率受配伍比例的影響較大，13#峰（香豆素）煎出率有較大提高，15#峰煎出率桂枝白芍（1∶1）配伍后有很大提高，可桂枝白芍（5∶3）、（1∶2）配伍時不受影響，16#峰（肉桂酸）煎出率桂枝白芍（5∶3）、（1∶2）配伍時降低，可桂枝白芍（1∶1）配伍后肉桂酸煎出率接近單味桂枝，煎出效果最佳。

各組HPLC指紋圖譜數(shù)據(jù)中白芍生藥量換算成一致的量，以白芍單煎樣品峰面積分別作為參比，將其他各樣品色譜圖中編號1、4、6、8、9、10、12、17的峰面積（除桂枝白芍共同峰外）與其峰面積相比，計算相對峰面積，結(jié)果見表5。由表5可知，白芍中共有峰各成分配伍后煎出率有很大提升，其煎出率提高與白芍比例成非線性關(guān)系，桂枝白芍（1∶1）、（1∶2）、（5∶3）配伍后白芍中共有峰各成分煎出率依次提高，桂枝白芍（5∶3）時煎出效果最佳。

3 討論

本研究優(yōu)選流動相過程中分別比較了乙腈流動相分離效果和洗脫能力都強(qiáng)于甲醇流動相，且部分成分不出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象，實驗發(fā)現(xiàn)加入0.1%醋酸有利于改善色譜峰的分離度和出峰峰型。

研究中發(fā)現(xiàn)白芍與桂枝不同比例配伍后，與單味白芍相比均明顯提高白芍中各成分的煎出率。芍藥苷在酸性條件下穩(wěn)定，pH對芍藥苷的溶解度有一定的影響。在pH 2.5～5范圍內(nèi)，芍藥苷的溶解度隨pH值的增加而增大，pH 5.0～6.8范圍內(nèi)，隨pH值的增加而減小，其中芍藥苷在pH 5.0時溶解度最大[19-20]。由于桂枝白芍對水煎液中含有原兒茶酸、沒食子酸、肉桂酸等有機(jī)酸和芍藥總苷類物質(zhì)，因此在一定程度上降低了水煎液中pH值，有利于增加芍藥苷等成分的溶解度，從而提高各成分的煎出率。桂枝白芍三種不同比例配伍產(chǎn)生有機(jī)酸含量的不同及溶液pH值的改變，可能是引起芍藥苷等成分煎出率差異的主要原因之一。

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（收稿日期：2017-01-04 本文編輯：張瑜杰）