GST-CBX2-1融合蛋白表達載體的構建及其在原核細胞中的表達①

劉婷雋，洪澤輝，胡安康

(1.徐州醫(yī)科大學實驗動物中心，江蘇 徐州 221004;2.東南大學基礎醫(yī)學院，江蘇 徐州 221004)

GST-CBX2-1融合蛋白表達載體的構建及其在原核細胞中的表達①

劉婷雋1，洪澤輝2，胡安康1

(1.徐州醫(yī)科大學實驗動物中心，江蘇 徐州 221004;2.東南大學基礎醫(yī)學院，江蘇 徐州 221004)

目的：構建GST標簽的CBX2-1融合蛋白表達載體，并在大腸桿菌中誘導表達，純化出表達蛋白。方法：以CBX2-1全長為模板，構建3對引物，將CBX2-1PCR擴增成3段，通過XhoⅠ和NotⅠ酶切位點將其定向插入pGEX-4T-3載體中，并轉(zhuǎn)化E.coliDH5ɑ，通過限制性內(nèi)切酶酶切電泳和DNA測序堅定正確后，轉(zhuǎn)入E.coliBL21中，經(jīng)IPTG大量誘導表達，SDS-PAGE電泳和Westernblot鑒定，運用GSTpulldown方法純化3段蛋白。結果：酶切電泳及測序結果證明，原核表達質(zhì)粒GST-CBX2-1 3個載體構建成功，用Westernblot方法證實了GST-CBX2-1-1(1-288)，GST-CBX2-1-2(259-600)，GST-CBX2-1-3(601-1596)融合蛋白的表達，并成功純化出3段蛋白。結論：成功構建了GST-CBX2-1-1，GST-CBX2-1-2，GST-CBX2-1-3原核表達載體，證實了其在原核細胞大腸埃希菌中的表達與純化，為進一步研究CBX2-1各結構域的功能提供了前提基礎。

CBX2-1蛋白；原核表達；載體構建；蛋白純化

多梳家族(PcG)蛋白可以作為組蛋白修飾激酶，通過調(diào)節(jié)染色質(zhì)高級結構參與基因表達的調(diào)控[1]。研究表明，PcG成員參與不同的細胞過程，例如干細胞分化、細胞命運決定、衰老、哺乳動物或腫瘤形成過程中調(diào)節(jié)X染色體的失活[2～4]。CBX2，是Pc家族同系物，N端含有染色質(zhì)結構域，C端含有高度保守的Pc盒[5，6]。在人類CBX2基因座上，含有兩個轉(zhuǎn)錄體，一個轉(zhuǎn)錄體是由5個外顯子組成含有532個基因的亞體CBX2-1，其包含保守的染色質(zhì)結構域和Pc盒。另一個轉(zhuǎn)錄體CBX2-2由4個外顯子組成包含211個基因，其只存在染色質(zhì)結構域，沒有Pc盒[7]。前人的研究發(fā)現(xiàn),CBX2-1比CBX2-2表達量更高，對CBX2-1的探究更深入，于是本實驗選取CBX2-1作為研究對象。為深入研究CBX2-1各結構域的功能及分子機制，我們利用分子克隆技術成功構建了CBX2-1-1、CBX2-1-2、CBX2-1-3基因原核表達載體，并在大腸埃希菌中誘導表達其融合蛋白，GSTpulldown成功純化3段蛋白，為CBX2-1各結構域功能的研究提供了基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 供試材料

CBX2-1模版由東南大學洪澤輝老師實驗室提供；引物合成由南京金斯瑞生物科技有限公司合成；RedTaqDNA聚合酶、10mmol/LdNTPs、10×PCRBuffer(Mg2+free) 、25mmol/LMgCl2、無菌雙蒸水ddH2O、瓊脂糖、溴化乙錠(EB)、TAE電泳緩沖液、SDS凝膠上樣緩沖液、半干轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)移緩沖液、Tris-Glycine電泳緩沖液。

1.1.2 引物設計

設計3對引物送南京金斯瑞公司合成，見表1。

表1 擴增目的基因的引物序列

F-1、F-259、F-601的5’端添加XhoⅠ酶切位點，R-288、R-600、R-1596的3’端添加NotⅠ酶切位點。

1.1.3 主要試劑盒

TaKaRaDNABluntingKit(DNA平滑化連接試劑盒)、TaKaRaTaqTM酶、TaKaRaMiniBESTPlasmidPurificationKitVer.2.0(質(zhì)粒提取試劑盒)和TaKaRaAgaroseGelDNAPurificationKitVer.2.0(瓊脂糖膠回收提純DNA試劑盒)購自寶生物工程(大連)有限公司;RestrictionEndonuclease(限制性內(nèi)切酶)與T4DNALigase(T4DNA連接酶)購自NEB(北京)生物科技有限公司、GSTResin購于南京金斯瑞公司、兔抗鼠二抗(HRP標記)購于上海Genetech公司、ECLplus購于美國GE公司。

1.1.4 主要儀器設備

MJPCR擴增儀、Eppendorf移液槍、Eeppendorf超速冷凍離心機、DYY-8C型電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)、恒溫搖床、恒溫培養(yǎng)箱、恒溫干燥箱、低溫冰箱、超低溫冰箱、超凈工作臺、高壓滅菌鍋、SP-2102UV型微量紫外分光光度計、LQP-B-4顆粒測定儀(制冰機),超聲機等。

1.2 實驗方法

1.2.1GST-CBX2-1-1(1-288)，GST-CBX2-1-2(259-600)，GST-CBX2-1-3(601-1596)融合蛋白表達載體的構建

PCR擴增CBX2-13段基因，將pGEX-4T-3載體和CBX2-1 3段PCR產(chǎn)物分別用NotⅠ和XhoⅠ兩個限制性內(nèi)切酶雙酶切，并進一步純化，T4DNA連接酶16℃連接4h，然后涂到含有氨芐抗性的培養(yǎng)板上，37℃過夜，挑取白色克隆，轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細胞中，37℃、250rpm過夜培養(yǎng)。提取質(zhì)粒后酶切及測序驗證。

1.2.2 重組蛋白在原核細胞中的大量表達

將鑒定正確的重組質(zhì)粒pGEX-4T-CBX2-1及pGEX-4T-3空載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21,37℃、250rpm振蕩培養(yǎng)過夜。過夜的培養(yǎng)液以1:50轉(zhuǎn)接于含100mL新鮮培養(yǎng)基的錐形瓶中，37℃、250rpm振蕩培養(yǎng)1.5～2h，使OD值達0.4～0.6。加入IPTG(終濃度為0.5mM，37℃、250rpm條件下培養(yǎng)8h。

1.2.3GST-CBX2-1-1(1-288)，GST-CBX2-1-2(259-600)，GST-CBX2-1-3(601-1596)融合蛋白的純化

誘導后的細菌在4℃、5000rpm條件下離心15min，用冰PBS洗一次，離心去上清。取沉淀菌體，向沉淀中加入8mLPBS和終濃度為1mM的PMSF，超聲破碎大腸桿菌細胞，超聲條件為：超10s，停10s，40%功率，15min。整個超聲過程需在冰上進行，以防超聲過程中蛋白質(zhì)預熱變性。

超聲后，12000rpm，離心15min取上清，分別與GlutathioneResinbeads孵育，4℃旋轉(zhuǎn)過夜，次日，3000rpm，5min，離心收集珠子。用含有500mMNacl，1%TritonX-100的PBS洗滌珠子，4℃旋轉(zhuǎn)5min，共5次。離心收集珠子，SDS-PAGE電泳后考馬斯亮藍染色檢測純化結果。

1.2.4 Western Blot

將純化好的珠子，加入適量SDS loading buffer裂解，100℃、煮沸5min。12000rpm、離心15min，取上清。等量的蛋白通過12%的SDS-PAGE凝膠進行跑膠分離，并轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用2%脫脂奶粉封閉1h，并分別用GST(1:2000)、p53(1:1000)、抗體孵育，4℃孵育過夜，TBST洗膜；加入HRP標記的羊抗鼠(1:2000)二抗，室溫孵育2h，TBST洗膜；ECL顯色、發(fā)光。

2 結果

2.1 PCR反應擴增3段CBX2-1基因

在本實驗中，我們將其分為1-288,259-600,601-1596三段，分別對CBX2-1所分的3段基因進行PCR擴增，可見約288bp、342bp、997bp的特異性片段與預期相符，見圖1。

2.2 GST-CBX2-1-1(1-288)，GST-CBX2-1-2(259-600)，GST-CBX2-1-3(601-1596)原核表達載體的構建及鑒定

重組質(zhì)粒GST-CBX2-1-1、GST-CBX2-1-2、GST-CBX2-1-3經(jīng)XhoⅠ和NotⅠ雙酶切后得到相應大小的條帶，見圖2，與預期一致，進一步測序鑒定正確。

圖1 CBX2-1的3段目的基因PCR產(chǎn)物電泳圖

M DNA標志物；1、2、3分別為CBX2-1 3段目的基因的PCR產(chǎn)物

圖2 GST-CBX2-1-1，GST-CBX2-1-2，GST-CBX2-1-3經(jīng)XhoⅠ和NotⅠ雙酶切結果電泳圖

2.3 GST-CBX2-1-1(1-288)，GST-CBX2-1-2(259-600)，GST-CBX2-1-3(601-1596) 重組質(zhì)粒在大腸桿菌BL21中的誘導表達

將3個重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E.coli BL21中，在0.5mmol/L IPTG、30℃下，誘導表達3h，考馬斯亮藍染色后在40kDa、42kDa、68kDa附近出現(xiàn)明顯的特異性條帶，其分子量與預期相符，見圖3。

圖3 考馬斯亮藍染色鑒定GST-CBX2-13段蛋白在原核細胞中的表達

2.4 GST-CBX2-1-1、GST-CBX2-1-2、GST-CBX2-1-3 融合蛋白的純化及鑒定

運用GST pull down實驗原理，對CBX2-1的3段基因表達的蛋白質(zhì)進行純化，SDS-PAGE電泳分離，考馬斯亮藍染色后在40 kDa、42 kDa、68 kDa附近出現(xiàn)明顯的特異性條帶，其分子量與預期相符，見圖4。

2.5 Western Blot檢測CBX2-1的3段蛋白的純化結果

Western Blot進一步鑒定GST-CBX2-1-1、GST-CBX2-1-2、GST-CBX2-1-3的表達，結果可見在40 kDa、42 kDa、68 kDa附近出現(xiàn)明顯的特異性條帶，見圖5，說明成功表達出3段重組融合蛋白。

圖4 考馬斯亮藍檢測GST pull down純化CBX2-1 3段蛋白

圖5 Western Blot檢測CBX2-1的3段蛋白的純化

3 討論

CBX2參與人類性成熟過程，它和鼠中同源蛋白M33都是PcG家族成員。研究發(fā)現(xiàn)[8]，與其他的前列腺癌相比，在神經(jīng)性前列腺癌中CBX2作為作重要的表觀遺傳學上調(diào)因子。CBX2的高表達與患者的預后結果差及更嚴重的腫瘤表型密切相關，并符合神經(jīng)性前列腺癌的臨床特征。人類CBX2存在兩個轉(zhuǎn)錄本，CBX2-1含有532個基因，CBX2-2含有211個基因。為了深入研究CBX2-1各結構域的生物學功能，構建CBX2-1的原核表達載體是關鍵之一。在本研究中，我們根據(jù)CBX2-1的空間結構將CBX2-1分成3段，成功構建GBX2-1-1

(1-288)，CBX2-1-2(259-600)，CBX2-1-3(601-1596)的原核表達載體，并利用IPTG進行大量誘導表達，獲得GST-GBX2-1-1，GST-CBX2-1-2，GST-CBX2-1-3純化蛋白。在載體選擇上，我們采用了pGEX-4T-3載體，此類載體帶有GST標簽，能夠增加目的蛋白的溶解度，融合蛋白可以很方便地從細菌細胞裂解液中用Glutathione Sepharose等柱料吸附純化。pGEX載體帶有一個tac啟動子，可作誘導表達用，適用于任何大腸桿菌，并且可以用溫和的洗脫條件從親和介質(zhì)上洗脫下來，最大限度地減少對抗原性的活性損傷。

本研究為進一步了解CBX2-1蛋白各結構域的功能提供了分子生物學的基礎，并為進一步探索CBX2-1相互作用的蛋白及其與腫瘤發(fā)生發(fā)展的關系提供了新思路。

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江蘇省高校自然科學基金資助項目，編號：13KJD180003。

劉婷雋(1990～)女，江蘇徐州人，碩士，助理實驗師。

胡安康(1981～)男，江蘇徐州人，博士，高級實驗師。E-mail：5501908@qq.com。

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1008-0104(2017)03-0118-03

2017-03-16)