JNK通路參與Aβ1-40誘導的海馬神經(jīng)干細胞凋亡過程①

王國輝，王麗華，秦麗紅，王 璇，高鳳榮，王昆祥

(佳木斯大學附屬第一醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154003)

JNK通路參與Aβ1-40誘導的海馬神經(jīng)干細胞凋亡過程①

王國輝，王麗華，秦麗紅，王 璇，高鳳榮，王昆祥

(佳木斯大學附屬第一醫(yī)院，黑龍江 佳木斯 154003)

目的：探討在Aβ1-40誘導的海馬神經(jīng)干細胞凋亡過程中JNK通路的作用。方法：應(yīng)用Westernblot技術(shù)檢測Aβ1-40(5μM)慢性孵育12h、24h和48h對海馬神經(jīng)干細胞JNK磷酸化水平的影響；在Aβ1-40(5μM)孵育前30min加入JNK阻斷劑SP600125(10μM)共同孵育12h、24h和48h，應(yīng)用Hoehest33342染色和MTT法檢測SP600125與Aβ1-40聯(lián)合作用后對神經(jīng)干細胞凋亡的影響。結(jié)果：在不同時間點，JNK磷酸化水平均增加，24h表達最顯著(P<0.01)；給予SP600125后可使Aβ1-40誘導的神經(jīng)干細胞死亡明顯減輕。結(jié)論：Aβ1-40激活JNK通路后促進了海馬神經(jīng)干細胞凋亡。

Aβ1-40；JNK；凋亡

c-Jun氨基末端激酶(c-JunN-terminalkinase,JNK)屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedproteinkinase,MAPK)超家族的成員之一。JNK通路常存在于多種生命過程中，如細胞分化和細胞死亡等[1]，是一條與細胞凋亡相關(guān)的重要信號轉(zhuǎn)導途徑。有文獻報道，JNK通路可被多種凋亡刺激因素所激活，而且當JNK活性降低或JNK通路被抑制時，可在一定程度上對神經(jīng)細胞的死亡起到保護作用[2]。而大量研究證實，阿爾茨海默病(Alzheimer’sdisease,AD)是由β-淀粉樣多肽(Aβ)聚集誘導神經(jīng)細胞損傷甚至凋亡所致[3,4]。因此，對JNK通路的研究有助于為揭示AD的發(fā)病機制提供依據(jù)。本實驗以Aβ1-40和SP600125為施加因素，觀察JNK通路在Aβ1-40誘導的神經(jīng)干細胞凋亡中的作用，為探究AD的發(fā)病機制提供理論及實驗依據(jù)。

1 實驗材料與方法

1.1 實驗動物

健康Sprague-Dawley(SD)大鼠(<72h)，雌雄均可，購于佳木斯大學實驗動物中心。

1.2 主要實驗藥品

Aβ1-40購于Biosouxee公司，MTT、Hoechst33342、TEA購于Sigma公司。

1.3 實驗方法

1.3.1Westernblot技術(shù)

將細胞經(jīng)裂解液處理后提取蛋白樣品，取50μg蛋白樣品上樣，進行SDS-PAGE電泳，電泳結(jié)束后進行轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜結(jié)束后封閉1h，一抗孵育并4℃過夜，TBS-T溶液洗膜后孵育二抗1h，TBS-T溶液洗膜后進行ECL顯影，掃片及數(shù)據(jù)處理分析。

1.3.2MTT法

在神經(jīng)干細胞中加入20μL的MTT溶液(5mg/mL)，置37℃培養(yǎng)4h，吸去培養(yǎng)液后加入150μL二甲基亞砜(DMSO)，低速振蕩10min，酶標儀OD570nm處檢測各孔吸光值。

1.3.3Hoechst33342法

在細胞中加入4%多聚甲醛，與培養(yǎng)液以1：3混合，固定細胞10min。去除固定液，在各組細胞中加入Hoechst33342，37℃孵育15min。吸除染色液并洗滌后，直接在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1Aβ1-40慢性孵育對海馬神經(jīng)干細胞JNK磷酸化水平的影響

Aβ1-40(5μM)慢性孵育12h、24h和48h后，應(yīng)用Westernblot技術(shù)檢測Aβ1-40對海馬神經(jīng)干細胞中JNK的影響。結(jié)果顯示，在不同時間點，JNK磷酸化水平均增加，24h表達最顯著(n=3，P<0.05)。見圖1。

圖1 Aβ1-40慢性孵育對海馬神經(jīng)干細胞JNK磷酸化水平的影響

*P<0.05

2.2SP600125與Aβ1-40聯(lián)合作用對海馬神經(jīng)干細胞凋亡的影響

在Aβ1-40(5μM)孵育前30min加入SP600125(10μM)，與Aβ1-40共同孵育12h、24h和48h，應(yīng)用MTT法觀察其對海馬神經(jīng)干細胞存活率的影響。結(jié)果顯示，SP600125可明顯減輕Aβ1-40誘導的神經(jīng)干細胞死亡，使細胞存活率明顯升高(P<0.01)。見圖2。

圖2 SP600125與Aβ1-40聯(lián)合作用對海馬神經(jīng)干細胞存活率的影響

(與對照組相比#P<0.01；與Aβ1-40組相比*P<0.01)

在Aβ1-40(5μM)孵育前30min加入SP600125(10μM)，與Aβ1-40共同孵育48h，應(yīng)用Hoehest33342染色觀察其對海馬神經(jīng)干細胞凋亡發(fā)生率的影響。結(jié)果顯示，SP600125可明顯降低Aβ1-40所引起的細胞凋亡發(fā)生率，由(18.2±1.7)%降至(8.1±06)%(P<0.01)。

3 討論

AD是一種與衰老相關(guān)并以記憶和認知功能障礙為主要特征的退行性腦病，其主要病理特征為新皮層、海馬等處出現(xiàn)Aβ沉積形成的高度老年斑、神經(jīng)纖維纏結(jié)和大量神經(jīng)元的減少等[5]。其中，Aβ沉積形成老年斑進而導致神經(jīng)細胞損傷甚至凋亡是AD發(fā)病的核心因素，因此，探究Aβ導致神經(jīng)細胞凋亡的過程是非常有必要的，它可為明確Aβ的毒性作用機制提供依據(jù)。近年來有大量相關(guān)文獻報導，JNK通路是一條與神經(jīng)細胞凋亡相關(guān)的常見信號轉(zhuǎn)導通路[6,7]，因此，可以做進一步研究以明確JNK通路是否參與了Aβ導致的神經(jīng)細胞凋亡過程，這對于揭示AD的發(fā)病機制有重要意義。本實驗以Aβ1-40和SP600125為施加因素，觀察了SP600125在Aβ1-40所

誘導的海馬神經(jīng)干細胞凋亡中的作用，結(jié)果顯示，Aβ1-40可增加JNK磷酸化水平的蛋白表達；給予SP600125后可使Aβ1-40誘導的神經(jīng)干細胞死亡明顯減輕。這些結(jié)果表明，JNK通路的激活參與了Aβ1-40誘導的海馬神經(jīng)干細胞凋亡過程，即，Aβ1-40激活JNK通路后引起了海馬神經(jīng)干細胞的凋亡。在前期工作中發(fā)現(xiàn)延遲整流鉀通道也參與了Aβ1-40誘導的海馬神經(jīng)干細胞凋亡過程，那么，JNK通路與延遲整流鉀通道在Aβ1-40誘導的海馬神經(jīng)干細胞凋亡過程是否存在一定的聯(lián)系呢？在今后的實驗中可進一步研究，以更加明確Aβ1-40誘導的細胞凋亡過程的機制。

[1]IpYT,DavisRJ.Signaltransductionbythec-JunN-terminalkinase(JNK)-frominflammationtodevelopment[J].CurrOpinCellBiol, 1998, 10:205-219

[2]CarolMTroy,SylviaARabacchi,ZhihengXu,etal.β-Amyloid-inducedneuronalapoptosisrequiresc-JunN-terminalkinaseactivation[J].J-Neurochem, 2001, 77(1):157-164

[3]田嘉瑩，盛寶英，齊志國.β1-40致傷的神經(jīng)干細胞的存活率及Caspase-3的活性變化[J].黑龍江醫(yī)藥科學，2013，36(1)：111-112

[4]張金波，王淑秋，張虎，等.靈芝孢子粉對戊四氮活化海馬神經(jīng)細胞bcl-2表達的研究[J].黑龍江醫(yī)藥科學，2012，35(4)：34-35

[5]VillafloresOB,ChenYJ,ChenCP,etal.Curcuminoidsandresveratrolasanti-Alzheimeragents[J].Taiwanesejournalofobstetrics&gynecology, 2012,51(4):515-525

[6]DonnaBozyczko-Coyne,TeresaMO’Kane,Zhi-LiangWu,etal.CEP-1347/KT- 7515,aninhibitorofSAPK/JNKpathwayactivation,promotessurvivalandblocksmultipleeventsassociatedwithAβ-inducedcorticalneuronapoptosis[J].JournalofNeurochemistry, 2001, 77:849-863

[7]欒倩，劉蕾，劉君星，等.靈芝酸對癇樣放電海馬神經(jīng)元ERK1/2磷酸化水平的影響[J].黑龍江醫(yī)藥科學，2014，37(2)：1-3

黑龍江省教育廳科學技術(shù)研究項目，編號：12521569。

王國輝(1971～)男，黑龍江佳木斯人，碩士，副主任醫(yī)師。

Q342+

A

1008-0104(2017)03-0008-02

2017-03-18)