三種藥物相關(guān)基因多態(tài)性在黑龍江省東部地區(qū)糖尿病患者中的分布①

方 舟，方 芳，季方茹，李艷翠

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院藥劑科，黑龍江 佳木斯 154003)

三種藥物相關(guān)基因多態(tài)性在黑龍江省東部地區(qū)糖尿病患者中的分布①

方 舟，方 芳，季方茹，李艷翠

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院藥劑科，黑龍江 佳木斯 154003)

目的：比較黑龍江佳木斯地區(qū)健康人群和2型糖尿病患者中藥物相關(guān)基因TCF7L2SNPrs12255372、IRS-1SNPrs2943650、MTHFRC677TSNPrs1801133基因多態(tài)性的分布，為糖尿病患者的診斷與個(gè)體化治療提供臨床依據(jù)。方法：應(yīng)用熒光染色原位雜交法(Fish法)檢測(cè)佳木斯地區(qū)健康人群和2型糖尿病(T2DM)患者TCF7L2、IRS-1、MTHFRC677T的基因型。采用SPSS17.0軟件，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)方法分析。結(jié)果：佳木斯地區(qū)健康人群和2型糖尿病患者TCF7L2、IRS-1的三種基因型頻率分布組間比較P>0.05，基因型分布無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；MTHFRC677T三種基因型頻率分布組間比較(P<0.05)，基因型分布有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論：黑龍江佳木斯地區(qū)健康人群MTHFRC677TSNPrs1801133位點(diǎn)基因多態(tài)性分布與2型糖尿病患者存在關(guān)聯(lián)；IRS-1SNPrs2943650、TCF7L2SNPrs12255372基因位點(diǎn)與2型糖尿病患者沒有相關(guān)性。

糖尿病，藥物相關(guān)基因，基因多態(tài)性，熒光原位雜交

1 儀器和試劑

熒光原位雜交DNA測(cè)序分析程序：北京華夏時(shí)代基因科技發(fā)展有限公司；TL-988實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀：西安天隆科技儀器有限公司；掌式離心機(jī)：珠海博邁杰生物科技有限公司；HC-3017高速離心機(jī)：科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司；PHARM-GENE200SNP分析樣品處理試劑，PHARM-GENE01SNP分析保存液(北京華夏時(shí)代基因科技

發(fā)展有限公司)。

2 方法

2.1 標(biāo)本來(lái)源

選取2014-06～2016-06住院的2型糖尿病患者324例，體檢健康人270例，糖尿病排除1型糖尿病、妊娠型糖尿病和特殊類型糖尿病，診斷依據(jù)WHO1998年新的診斷標(biāo)準(zhǔn)。

2.2 基因檢測(cè)

2.2.1 基因多態(tài)性檢測(cè)方法

檢測(cè)條件：95℃預(yù)變性600s；95℃變性30s，62℃復(fù)性75s，45或50個(gè)循環(huán)。在樣品檢測(cè)的同時(shí)，加測(cè)3種不同基因型的質(zhì)控品作為對(duì)照。

方法：取150μL新鮮全血加入含有1000μL氯化銨溶液的Eppendorf試管中，混合混勻后室溫放置5min，離心5min，加入100μL耀金保，震蕩混合混勻，室溫放置20～30min。吸取本液1.0～1.5μL加入待測(cè)基因?qū)?yīng)的耀金分試劑中，漩渦混合均勻，瞬時(shí)離心，上至機(jī)器中檢測(cè)。

解析：分析已知反應(yīng)物和產(chǎn)物,結(jié)合題意“調(diào)節(jié)pH≈3”可知缺項(xiàng)是 H+,Ce3+→Ce(OH)4,失1 e-,H2O2→Ce(OH)4,得2 e-,根據(jù)得失電子守恒,Ce3+前的化學(xué)計(jì)量數(shù)為2,H2O2前的化學(xué)計(jì)量數(shù)為1,再根據(jù)電荷守恒,H+前的化學(xué)計(jì)量數(shù)為6,最后觀察可知H2O2前的化學(xué)計(jì)量數(shù)為6,配平的方程式為2Ce3++H2O2+6H2O==2Ce(OH)4↓+6H+。

2.2.2 基因型的判斷

將檢測(cè)的樣品熒光曲線圖與質(zhì)控品曲線圖進(jìn)行比較。

TCF7L2SNPrs12255372熒光擬合曲線見圖1；IRS1SNPrs2943650熒光擬合曲線見圖2；MTHFRSNPrs1801133熒光擬合曲線見圖3。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件χ2檢驗(yàn)來(lái)計(jì)算糖尿病組和健康人組的三種基因型的分布頻率，P<0.05為差異具有顯著性。

圖1 TCF7L2 SNP rs12255372(G>T)熒光擬合曲線

圖2 IRS 1 SNP rs2943650(C>T)熒光擬合曲線

圖3 MTHFR SNP rs1801133(C>T)熒光擬合曲線

3 結(jié)果

3.1TCF7L2基因多態(tài)性在健康人和糖尿病患者中的分布

選取健康人對(duì)照組270例，糖尿病患者324例，按上述方法測(cè)定TCF7L2SNPrs12255372基因型，結(jié)果：GG基因型155例，分布頻率為57.4%；GT型75例，頻率27.8%；TT型40例，頻率14.8%，其中G等位基因頻率為66.7%，T等位基因頻率為33.3%。糖尿病患者324例，TCF7L2SNPrs12255372基因GG型170例，頻率52.5%；GT型86例，頻率26.5%；TT型68例，頻率21.0%，其中G等位基因頻率為65.7%，T等位基因頻率為34.3%。健康人與糖尿病患者TCF7L2基因分布頻率見表1。

表1 健康人與糖尿病患者TCF7L2基因型分布頻率表

對(duì)照組與糖尿病組TCF7L2SNPrs12255372其等位基因概率經(jīng)χ2檢驗(yàn)，可知(χ2=0.104，P>0.05)，其等位基因分布頻率沒有顯著性差異，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。三種基因型GG/GT/TT分布頻率，經(jīng)χ2檢驗(yàn)，可知(χ2=3.826，P>0.05)，三種基因型分布頻率沒有差異性，不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3.2IRS-1 基因多態(tài)性在健康人和糖尿病患者中的分布

選取糖尿病患者324例，按上述方法測(cè)定IRS1SNPrs2943650基因型：測(cè)定結(jié)果：CC型6例，頻率1.9%；CT型36例，頻率11.1%；TT型282例，頻率87%，其中C等位基因頻率為48%，T等位基因頻率為92.2%。選取健康人對(duì)照組270例，測(cè)定結(jié)果：CC型9例，頻率3.3%；CT型36例，頻率13.3%；TT型225例，頻率83.3%，其中C等位基因頻率為10%，T等位基因頻率為90%。健康人與糖尿病患者IRS-1基因型分布頻率見表2。

表2 健康人與糖尿病患者IRS 1基因型分布頻率表

對(duì)照組與糖尿病患者IRS-1SNPrs2943650基因型頻率，其等位基因概率經(jīng)χ2檢驗(yàn)，可知(χ2=1.654，P>0.05)，其等位基因分布頻率無(wú)顯著性差異，不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。三種基因型CC/CT/TT頻率經(jīng)χ2檢驗(yàn)，可知(χ2=2.117，P>0.05)，三種基因型分布頻率沒有差異性，不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3.3MTHFR基因多態(tài)性在健康人和糖尿病患者中的分布

選取健康人對(duì)照組270例，測(cè)定MTHFRSNPrs1801133基因，結(jié)果：CC型36例，頻率13.3%；CT型135例，頻率50%；TT型99例，頻率36.7%，其中C等位基因頻率為38.3%，T等位基因頻率為61.7%。測(cè)定糖尿病患者324例，MTHFRSNPrs1801133基因CC型70例，頻率21.6%；CT型119例，頻率36.7%；TT型135例，頻率41.7%，其中C等位基因頻率為40.0%，T等位基因頻率為60.0%。健康人與糖尿病患者M(jìn)THFR基因分布概率見表3。

表3 健康人與糖尿病患者M(jìn)THFR基因型分布頻率表

對(duì)照組與糖尿病組MTHFR677等位基因概率經(jīng)χ2檢驗(yàn)，可知(χ2=0.331，P>0.05)，其等位基因分布頻率沒有顯著性差異。對(duì)照組與糖尿病組MTHFR677基因CC/CT/TT三種基因型頻率，經(jīng)χ2檢驗(yàn)，可知(χ2=12.647，P<0.05)，三種基因型分布頻率有顯著性差異性，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4 討論

TCF7L2基因(又稱T細(xì)胞因子-4)是Wnt信號(hào)傳導(dǎo)通路中的轉(zhuǎn)錄因子，參與細(xì)胞增殖與分化的調(diào)節(jié)[5]，它位于人類10號(hào)染色體長(zhǎng)臂25區(qū)(染色體10q25.3)，共有2159個(gè)堿基對(duì)，包含17個(gè)外顯子，其表達(dá)產(chǎn)物是T細(xì)胞因子/淋巴細(xì)胞增強(qiáng)子結(jié)合因子中的一個(gè)。一些研究認(rèn)為TCF7L2基因變異與2型糖尿病相關(guān)[7]，但是同時(shí)也有研究認(rèn)為沒有關(guān)聯(lián)[8]。這可能是不同的研究者選取的基因位點(diǎn)及病例入選標(biāo)準(zhǔn)不同有關(guān)。總之關(guān)于TCF7L2基因多態(tài)性與2型糖尿病的關(guān)聯(lián)還沒有定論，有必要進(jìn)行大樣本深入研究。本試驗(yàn)研究本地區(qū)健康人TCF7L2TSNPrs12255372基因多態(tài)性與2型糖尿病患者的基因多態(tài)性不相關(guān)。MTHFR基因位于染色體1q36.3，編碼區(qū)長(zhǎng)1980bp，MTHFR基因的677位堿基胞嘧啶(Cytosine,C)變異為胸腺嘧啶(Thymine,T)，使編碼的丙氨酸(Ala)變異為纈氨酸(Val)[9]而產(chǎn)生多態(tài)性，它與很多疾病相關(guān)[10]，本實(shí)驗(yàn)表明MTHFRSNPrs1801133三種基因型分布頻率在黑龍江省佳木斯地區(qū)健康人和糖尿病患者中有顯著性差異性。胰島素受體底物1(IRS-1)基因突變導(dǎo)致胰島素對(duì)血小板活性的抑制作用削弱，導(dǎo)致胰島素抵抗。胰島素受體底物1(IRS-1)廣泛存在于胰島素敏感的組織中，在胰島素受體信號(hào)傳導(dǎo)通路中處于關(guān)鍵部位，是胰島素受體激酶的第一個(gè)直接底物。本實(shí)驗(yàn)對(duì)IRS-1SNPrs2943650基因CC/CT/TT三種基因頻率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，經(jīng)χ2檢驗(yàn)，可知(χ2=2.117，P>0.05)，三種基因型分布頻率沒有差異性，不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

[1]唐金玲.胰島素抵抗的2型糖尿病患者細(xì)胞因子及CRP測(cè)定的意義[J].中國(guó)現(xiàn)代藥物應(yīng)用,2014,8(3):165-166

[2]王歆，方舟，方芳,等.糖尿病患者IRS-1和MTHFR基因多態(tài)性分析[J].黑龍江醫(yī)藥科學(xué)，2015，38(6)：46-47

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[7]邊澈,李佳,張曉蕾,等.轉(zhuǎn)錄因子7樣2基因290487-T/C多態(tài)性與2型糖尿病患者胰島素抵抗的相關(guān)性[J].中國(guó)生物制品學(xué)雜志,2012,25(8):1017-1020

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佳木斯大學(xué)科學(xué)技術(shù)面上項(xiàng)目，編號(hào)：S2014-031。

方舟(1984～)男，黑龍江佳木斯人，碩士，主管藥師。

李艷翠(1973～)女，黑龍江鶴崗人，碩士，主任藥師。E-mail:liyancui3400@163.com。

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1008-0104(2017)03-0084-03

2016-12-08)