TGF-β1、PTEN在口腔鱗癌組織中的表達(dá)及意義①

楊永超，段 峰，張 璇

(1.佳木斯大學(xué)研究生學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007；2.佳木斯大學(xué)附屬第二醫(yī)院口腔醫(yī)學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154002)

TGF-β1、PTEN在口腔鱗癌組織中的表達(dá)及意義①

楊永超1，段 峰2，張 璇1

(1.佳木斯大學(xué)研究生學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007；2.佳木斯大學(xué)附屬第二醫(yī)院口腔醫(yī)學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154002)

目的：檢測(cè)TGF-β1及PTEN蛋白在口腔鱗癌(OSCC)和口腔癌旁正常組織中的表達(dá)，旨在探討兩者在OSCC發(fā)展過程中可能存在的機(jī)制。方法：采用免疫組化SABC法，檢測(cè)51例口腔鱗癌組織和18例口腔癌旁正常組織樣本中TGF-β1及PTEN蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果：TGF-β1及PTEN在OSCC組織和癌旁正常組織中均有表達(dá)，TGF-β1在OSCC組織及癌旁正常組織中的表達(dá)率為67.2%、16.7%(P<0.05)；而PTEN表達(dá)率分別為39.2%、77.8%(P<0.05)；TGF-β1、PTEN在OSCC組織中的陽(yáng)性率與年齡、性別以及吸煙指數(shù)無關(guān)(P>0.05)，但與臨床分期、淋巴轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)；PTEN的陽(yáng)性率還與分化程度有關(guān)(P<0.05)；且TGF-β1與PTEN的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.295，P<0.05)。結(jié)論:TGF-β1的高表達(dá)和PTEN的低表達(dá)可能與OSCC的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，并有可能成為OSCC的臨床診斷依據(jù)。

TGF-β1；PTEN；口腔鱗癌

口腔鱗狀細(xì)胞癌(oralsquamouscellcarcinomaOSCC)是口腔頜面部最常見惡性腫瘤，比例約占90%[1]。雖然OSCC的臨床效果已逐漸提高，然而總的5年生存率卻很低。擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移是影響惡性腫瘤患者生存時(shí)間和生存質(zhì)量的主要因素之一[2]，其生存率高度依賴于腫瘤的診斷階段。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1 (TGF-β1)一個(gè)調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)與分化、細(xì)胞凋亡的多功能因子，具有調(diào)節(jié)腫瘤生長(zhǎng)等作用。第10染色體同源缺失性磷酸酶-張力蛋白基因(PTEN)是一種抑癌基因，在多種腫瘤中出現(xiàn)表達(dá)下調(diào)和缺失現(xiàn)象，提示PTEN在腫瘤的發(fā)展過程中可能起抑制作用。本實(shí)驗(yàn)通過SABC法分別檢測(cè)在OSCC、癌旁正常組織中TGF-β1及PTEN的表達(dá)情況，旨在探討兩者在OSCC發(fā)展過程中可能存在的機(jī)制，進(jìn)一步為臨床診斷治療提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

標(biāo)本來源于2014-08～2016-03佳木斯大學(xué)附屬口腔醫(yī)院口腔頜面外科手術(shù)切除并且術(shù)后病理診斷為OSCC的成年患者，共51例。其中男30例，女21例；年齡>60歲組織標(biāo)本31例；≤60歲組織標(biāo)本20例；按照TNM分類標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行臨床分期，Ⅰ～Ⅱ期33例，Ⅲ～Ⅳ期18例；伴有頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移14例，未見淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移37例；按照2005年WHO制定的標(biāo)準(zhǔn)分為高-中分化41例，低分化10例；吸煙指數(shù)≤400有29例，>400有22例。另取18例癌旁正常組織，并經(jīng)HE染色，鏡下觀察證明無任何黏膜疾病。上述患者均有完整的臨床病理學(xué)資料，術(shù)前3個(gè)月內(nèi)均未接受放化療治療。

1.2 試劑

兔抗人TGF-β1、PTEN親和純化抗體，SABC檢測(cè)試劑盒以及DAB顯色試劑盒，均購(gòu)于武漢博士德生物有限公司。

1.3 免疫組化檢測(cè)

組織標(biāo)本全部均經(jīng)10%福爾馬林固定；常規(guī)石蠟包埋后按照4μm厚度作連續(xù)切片；抗原熱修復(fù)；SABC法染色(染色步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作)。在相同條件下與已知的陽(yáng)性切片作陽(yáng)性對(duì)照，用PBS代替一抗作陰性對(duì)照。

1.4 結(jié)果判定

標(biāo)本組織細(xì)胞中出現(xiàn)黃色或黃褐色為陽(yáng)性著色。TGF-β1的表達(dá)產(chǎn)物位于細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核中；PTEN的表達(dá)產(chǎn)物位于細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞膜中。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果根據(jù)標(biāo)本切片的著色強(qiáng)度以及陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)在總細(xì)胞數(shù)中的占比這兩方面進(jìn)行綜合分析判定。判定OSCC細(xì)胞的著色強(qiáng)度：無著色(-)，淡黃色(+)，黃色()，黃褐色()。判定陽(yáng)性O(shè)SCC細(xì)胞占比：400倍顯微鏡下在切片中隨機(jī)選擇5個(gè)細(xì)胞視野，陽(yáng)性細(xì)胞占比≤10%(-)，11%～25%(+)，26%～49%()；≥50%()；(-)、(+)、()、()分別代表0分、1分、2分、3分。每張切片的總分按著色強(qiáng)度與陽(yáng)性細(xì)胞百分比兩項(xiàng)分值相加得出。陰性(<2分)，陽(yáng)性(≥2分)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS21.0軟件，采用卡方進(jìn)行組間數(shù)據(jù)比較；使用Spearman秩相關(guān)檢驗(yàn)分析指標(biāo)之間的關(guān)系。均以α=0.05為檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1TGF-β1、PTEN在OSCC、癌旁正常組織中的表達(dá)

TGF-β1蛋白、PTEN蛋白在OSCC組織中陽(yáng)性表達(dá)率分別為62.7%(32/51)、39.2%(20/51)；在癌旁正常組中陽(yáng)性表達(dá)率為16.7%(3/18)、77.8%(14/18)。組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 TGF-β1、PTEN在OSCC組織中的表達(dá)與病理因素之間的關(guān)系

與同組比較*P>0.05，與同組比較**P<0.05，a患者手術(shù)時(shí)的中位年齡。

免疫組化SABC法檢測(cè)OSCC組織中TGF-β1、PTEN的表達(dá)，見圖1～2。

圖1TGF-β1(× 400)

圖2 PTEN (× 400)

2.2TGF-β1、PTEN在OSCC組織中的表達(dá)與病理因素之間的關(guān)系

TGF-β1、PTEN在OSCC組織中陽(yáng)性表達(dá)率與年齡、性別以及吸煙指數(shù)無關(guān)(P>0.05)，與臨床分期、頸淋巴轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)。PTEN的陽(yáng)性率還與分化程度有關(guān)(P<0.05)。見表1。

2.3TGF-β1、PTEN在OSCC組織中表達(dá)關(guān)系

在51例OSCC組織標(biāo)本中，TGF-β1與PTEN同時(shí)為陽(yáng)性和陰性表達(dá)的分別為9例，8例；TGF-β1陽(yáng)性表達(dá)，PTEN為陰性表達(dá)為23例；TGF-β1陰性表達(dá)，PTEN為陽(yáng)性表達(dá)為11例。聯(lián)合檢測(cè)TGF-β1、PTEN在OSCC組織中的表達(dá)水平，兩者呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.295，P<0.05)，見表2。

表2 TGF-β1、PTEN在OSCC組織中表達(dá)關(guān)系

3 討論

轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(transforminggrowthfactor,TGF)β是一組調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)與分化、細(xì)胞凋亡的多功能生長(zhǎng)因子家族，在腫瘤的形成等過程中發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)規(guī)范的TGF-β途徑主要是通過Smad蛋白的表達(dá)完成信號(hào)傳導(dǎo)；而非規(guī)范TGF-β信號(hào)通路是通過MAPK信號(hào)通路完成傳導(dǎo)，在細(xì)胞遷移以及上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程中此信號(hào)通路具有至關(guān)重要的作用[3]。TGF-β1是TGF-β家族中重要成員之一，研究表明TGF-β1可調(diào)節(jié)細(xì)胞周期，促進(jìn)血管生成以及腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸[4，5]。在腫瘤的形成過程中TGF-β1發(fā)揮著相反的作用：在腫瘤生長(zhǎng)早期，TGF-β1可作為腫瘤的抑制物，使腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)停止，抑制腫瘤發(fā)展；但隨著腫瘤的進(jìn)展，TGF-β1成為促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)的促進(jìn)因子，促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)，浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移[6]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示TGF-β1在OSCC組中的陽(yáng)性表達(dá)率為62.7%，而癌旁正常組為16.7%(P<0.05)，可見TGF-β1蛋白表達(dá)是下調(diào)的，提示TGF-β1可能促進(jìn)OSCC的發(fā)生。在不同TNM分期中，TGF-β1蛋白的表達(dá)量分別Ⅰ～Ⅱ?yàn)?1.5%，Ⅲ～Ⅳ為83.3%(P<0.05)；同時(shí)伴頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中其陽(yáng)性表達(dá)率(85.7%)明顯高于頸淋巴結(jié)未轉(zhuǎn)移組(54.1%)(P<0.05)，表明TGF-β1表達(dá)率升高與腫瘤的臨床分期、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，提示其可作為判斷病情進(jìn)展的一個(gè)依據(jù)。但TGF-β1在OSCC組織中的表達(dá)與年齡、性別以及吸煙指數(shù)均無關(guān)(P>0.05)。有文獻(xiàn)報(bào)道[7]，TGF-β1蛋白的高表達(dá)與分化程度相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)對(duì)不同分化程度的OSCC組織進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)低分化組的TGF-β1蛋白陽(yáng)性表達(dá)率(80.0%)比高-中分化組(58.5%)高，但差異無顯著性(P>0.05)，此結(jié)果可能受抗體稀釋濃度、實(shí)驗(yàn)步驟等多種因素影響。

第10染色體同源缺失性磷酸酶-張力蛋白基因(PTEN)是被發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)具有雙重磷酸酶活性的腫瘤抑制基因。研究發(fā)現(xiàn)PTEN蛋白具有蛋白性磷酸酯酶活性，通過選擇性抑制有絲分裂原激活蛋白激酶MAPK途徑，使細(xì)胞生長(zhǎng)阻滯于G1期，抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，促進(jìn)其程序性細(xì)胞死亡。同時(shí)還具有脂質(zhì)磷酸酶活性，構(gòu)成了PI3K/PTEN/AKT通路，從而抑制細(xì)胞增殖分化，調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡[8]。近十余年來，研究發(fā)現(xiàn)PTEN可通過抑制血管生成、抑制細(xì)胞外基質(zhì)降解、促進(jìn)細(xì)胞分化等作用抑制腫瘤生成。PTEN蛋白的表達(dá)下降、缺失大多是在腫瘤進(jìn)展的后期階段被發(fā)現(xiàn)，如子宮頸癌[9]等。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在OSCC組中PTEN的陽(yáng)性表達(dá)率為39.2%，明顯低于癌旁正常組(77.8%)(P<0.05)，提示PTEN蛋白表達(dá)降低或缺失可能促使細(xì)胞突變。在TNM分期中PTEN蛋白的表達(dá)率分別Ⅰ～Ⅱ?yàn)?1.5%，Ⅲ～Ⅳ為16.7%(P<0.05)，表明PTEN的表達(dá)與OSCC的浸潤(rùn)程度相關(guān)；發(fā)現(xiàn)OSCC分化程度降低，PTEN的陽(yáng)性率也降低，低分化PTEN的陽(yáng)性率為10% ，高-中分化陽(yáng)性率為46.3%(P<0.05)，提示PTEN蛋白表達(dá)下調(diào)可能加劇了口腔鱗癌的惡化進(jìn)程。同時(shí)無頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的OSCC中PTEN蛋白表達(dá)率(48.6%)高于有頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(14.3%)，提示PTEN蛋白表達(dá)降低或缺失使OSCC易于轉(zhuǎn)移。此外PTEN在OSCC組織中的表達(dá)與年齡、性別以及吸煙指數(shù)皆無關(guān)(P>0.05)。以上結(jié)果與有關(guān)學(xué)者[10]在非小細(xì)胞肺癌組織中關(guān)于PTEN的研究相似。同時(shí)對(duì)TGF-β1、PTEN在OSCC組織中的表達(dá)水平進(jìn)行聯(lián)合統(tǒng)計(jì)分析后，發(fā)現(xiàn)兩者呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.295，P<0.05)，兩者在OSCC組織中的表達(dá)具有拮抗性。推測(cè)在OSCC中TGF-β1可能是通過MAPK信號(hào)途徑來調(diào)節(jié)PTEN的表達(dá)，TGF-β1對(duì)PTEN的生成起到負(fù)向調(diào)節(jié)作用，使PTEN的抑癌作用減弱。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)可得出TGF-β1在OSCC中呈高表達(dá)，而PTEN呈低表達(dá)，且與部分臨床病理因素關(guān)系密切，并且兩者的表達(dá)水平在口腔鱗癌組織中呈負(fù)相關(guān)；通過聯(lián)合檢測(cè)分析TGF-β1與PTEN在OSCC中的表達(dá)情況，對(duì)OSCC的臨床診斷具有一定的意義，有助于指導(dǎo)臨床治療，兩者有望成為診斷口腔鱗癌的檢測(cè)因子。

[1]TangH,WuZ,ZhangJ,etal.SalivarylncRNAasapotentialmarkerfororalsquamouscellcarcinomadiagnosis[J].MolecularMedicineReports, 2013, 7(3):761-766

[2]陳哲, 柳宏志, 劉繼光. 口腔鱗癌Ezrin蛋白和CD44v6表達(dá)及其與淋巴轉(zhuǎn)移的相關(guān)性研究[J]. 黑龍江醫(yī)藥科學(xué), 2010, 33(1):82-83

[3]ChapnickDA,WarnerL,BernetJ,etal.Partnersincrime:theTGFβandMAPKpathwaysincancerprogression[J].Cell&Bioscience, 2011, 1(1):1-8

[4]GuYY,WangH,WangS.TGF-β1C-509TandT869Cpolymorphismsandcancerrisk:ametaanalysis[J].InternationalJournalofClinical&ExperimentalMedicine, 2015, 8(10)：868

[5]FlavellRA,SanjabiS,WrzesinskiSH,etal.ThepolarizationofimmunecellsinthetumourenvironmentbyTGF-βNaturereviews[J].Immunology，2010，10(8):554-567

[6]DrabschY,DijkePT.TGF-βSignalinginBreastCancerCellInvasionandBoneMetastasis[J].JournalofMammaryGlandBiology&Neoplasia, 2011, 16(2):97-108

[7]馬穎, 楊向紅, 田保玲,等. 大腸腫瘤中PTEN和TGF-β1表達(dá)及意義[J]. 中國(guó)組織化學(xué)與細(xì)胞化學(xué)雜志, 2012, 21(1):53-56

[8]AlexiouGA,VoulgarisS.TheroleofthePTENgeneinmalignantgliomas[J].NeurolNeurochirPol，2010，44:80-86

[9]RizviMM,AlamMS,AliA,etal.AberrantpromotermethylationandinactivationofPTENgeneincervicalcarcinomafromIndianpopulation[J].JCancerResClinOncol，2011，137: 1255-1262

[10]鮑文華, 劉忠鑫, 劉磊.MMP-7和PTEN在非小細(xì)胞肺癌的表達(dá)及其意義[J]. 黑龍江醫(yī)藥科學(xué), 2011, 34(2):1-3

佳木斯大學(xué)研究生科技創(chuàng)新項(xiàng)目，編號(hào):LM2015-040。

楊永超(1990～)男，安徽馬鞍山人，在讀碩士研究生。

段峰(1972～)男，黑龍江齊齊哈爾人，學(xué)士，副教授，副主任醫(yī)師，碩士研究生導(dǎo)師。E-mail:duanffeng60@sohu.com。

R

A

1008-0104(2017)03-0072-03

2016-12-08)