大鼠脊髓不同程度損傷后早期血清中NSE和S-100β的表達①

王崇禧，周成福，蘇 航，張增增

(佳木斯大學附屬第一醫院，黑龍江 佳木斯 154003)

大鼠脊髓不同程度損傷后早期血清中NSE和S-100β的表達①

王崇禧，周成福，蘇 航，張增增

(佳木斯大學附屬第一醫院，黑龍江 佳木斯 154003)

目的：探索大鼠正常及不同程度脊髓損傷(SpinalCordInjury，SCI)后血清中神經元特異性烯醇化酶(NSE)和星形膠質源性蛋白(S-100β)的表達及規律。方法：取54只SD大鼠，隨機分成A、B、C、D、E、F6組。前4組選取改良Allen’s法建造不同程度SCI樣本，至傷能量經預實驗后選擇如下：A組(2.5cm×10g)、B組(4.5cm×10g)、C組(6.5cm×10g)、D組(8.5cm×10g)E組僅顯露脊髓，不致傷，F組正常觀察。打擊后大鼠發生擺尾，雙下肢及機體回縮，進而雙下肢自然松弛術，表明打擊確實，后行改良體感誘發電位(somatosensoryevokedpotential,SEP)檢測，評估脊髓損傷程度的可信性，去除不合格模型。術后3h、6h、12h、48h、72h時采用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)定量分析各組大鼠血清中NSE和S-100β變化。術后7d時行改良SEP評估神經功能損傷與恢復情況。結果：①在正常大鼠血清中存在微量NSE和S-100β。②一定損傷程度范圍內，ABCD四組模型相同時間點血清中NSE和S-100β定量分析較正常增多，損傷各組間檢測結果比較有差別(P<0.05)，脊髓損傷程度越重，血清中NSE和S-100β兩者陽性表達結果增加，脊髓損傷后6h，二者陽性表達達到最大值，呈正相關關系。③通過本實驗的數據分析，大鼠在輕度致傷后血清中NSE含量表達平均值達到6.26ng/mL，遠遠高于正常大鼠組。NSE和S-100β在本文的研究中發現不具有相關性。結論：①在正常大鼠血清中存在微量NSE和S-100β。②一定損傷程度范圍內，隨著損傷程度的增進，大鼠血清中NSE和S-100β表達有所升高，且與脊髓損傷的程度呈正相關，即：隨著程度的不斷加大，NSE和S-100β的陽性表達結果逐漸增多；大鼠脊髓損傷后6h的陽性表達量到達最大值，明顯高于對照組。因此可以認為一定程度上NSE和S-100β檢測可以作為評判、估計脊髓損傷程度的一種方法。③從本文數據分析，我們可以認為當大鼠血清中NSE含量大于6.26ng/mL時可能出現了脊髓的損傷，這有一定意義存在。NSE和S-100β兩者在研究中發現不具有相關性，這還需要我們進一步的探索。椎板切除術操作不會明顯影響大鼠血清中NSE和S-100β的定量分析以及改良SEP的檢測。

脊髓損傷；NSE；S-100β；血清；大鼠

SCI發病較為常見，常引起損傷平面以下感覺、運動、反射、植物神經功能紊亂，大小便失禁及性功能障礙，嚴重影響了病患及其家庭。烯醇化酶同工酶中的αγ及γγ型獨特地存在于神經元和神經內分泌細胞中，所以叫作神經元特異性烯醇化酶(NSE)。NSE絕大部分在中樞神經系統的灰質內，損傷的神經細胞變性壞死，得以釋放的NSE可通過血-脊髓屏障而進入外周血。S-100β可體現、揭示膠質細胞的損傷，是白質異常的標記[1]。損傷等因素活化膠質細胞而過度表達S-100β，使星形膠質細胞等形成致炎性因子以及一氧化氮，引發神經細胞功能障礙甚至死亡[2～5]。本研究采取ELISA試驗定量分析血清中的NSE和S-100β，以期為精確判斷、評估不同程度SCI提供一種新手段。

1 材料與方法

1.1 實驗對象

取健康SD大鼠54只，體重(220±10)g。隨機分成A～F共6組大鼠，每組9只。

1.2 制作模型和相關檢測

采取Allen's法建造不同程度SCI的大鼠模型。3%戊巴比妥鈉(30mg/kg)，麻醉(腹腔注射)成功后固定體位，去毛、消毒、鋪大小適宜無菌巾。取T10棘突為中心作后正中切口，嚴格參照手術入路規范及解剖特點，顯露出T10棘突后，仔細咬除T9～T11棘突及全部椎板，合理、適度顯露椎管及硬脊膜。于T10段脊髓上安放墊片，取打擊圓柱從不同高度處釋放。至傷能量經預實驗后選擇如下：A組(2.5cm×10g)、B組(4.5cm×10g)、C組(6.5cm×10g)、D組(8.5cm×10g)，標記發生擺尾，雙下肢及機體回縮，進而雙下肢自然松弛的大鼠，說明建造模型打擊確實[6,7]。術后立即進行改良SEP檢測，綜合評斷脊髓損傷程度的可信性，剔除不合格模型并予以補充。E組僅顯露脊髓，余操作與實驗組一致，以青霉素溶液沖洗術區后逐層縫合組織，F組正常觀察。術后注射抗生素，大鼠室溫下自由喂養，大鼠8h排尿一次，定時取血檢樣。

1.3 改良體感誘發電位(SEP)

麻醉滿意后穩固鼠頭，消毒，取頂正中切口，依次切開組織后以紗布擦去骨膜，使顱骨顯露面大小適宜。在矢狀縫左側冠狀縫后緣處，以牙科鉆鉆孔，孔無需打穿，保留薄層骨質，避免損傷顱腦。記錄并保存SEP波形疊加、平均處理后的數據。及時觀察術后及術后7d時大鼠SEP變化。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 大鼠脊髓不同程度損傷后NSE和S-100β定量分析：大鼠血清中存在微量NSE和S-100β。一定損傷程度范圍內，ABCD四組模型相同時間點血清中NSE和S-100β定量分析較正常增多，損傷各組間檢測結果比較有差別(P<0.05)，脊髓損傷程度越重，血清中NSE和S-100β含量增多,改良SEP恢復情況及后期癥狀改善越差(P<0.05)。大鼠不同程度脊髓損傷NSE和S-100β定量分析結果見表1～2，圖1～2。

圖1 NSE檢測標準曲線

組別ABCDEF3h6.26±1.148.20±1.1410.10±1.8316.03±1.351.74±0.351.27±0.396h10.67±1.4114.00±1.2717.46±2.3819.86±1.931.69±0.381.69±0.1912h9.19±1.6611.88±0.9515.14±1.8317.69±1.401.56±0.391.55±0.5348h8.85±1.2410.87±1.1915.31±0.9916.77±1.011.65±0.271.61±0.30

圖2 S-100β檢測標準曲線

組別ABCDEF3h0.26±0.020.31±0.040.35±0.030.39±0.050.08±0.0050.08±0.0066h0.36±0.030.62±0.030.76±0.050.87±0.050.08±0.0060.08±0.00412h0.30±0.020.52±0.070.59±0.050.71±0.050.08±0.0070.07±0.00648h0.31±0.020.51±0.080.59±0.020.67±0.020.08±0.0070.08±0.004

2.2 一定損傷程度范圍內，大鼠模型脊髓損傷越重，改良SEP恢復情況及后期癥狀改善越差(P<0.05)。見表3～4。

表3 各組不同時間SEP潛伏期,單位：ms)

表4 各組不同時間SEP波幅，單位：μv)

2.3 研究NSE和S-100β相關性的研究(pearson相關性=0.022，單位：ng/mL)，見圖3。

圖3 血清中NSE和S-100β的散點圖

該實驗結果表明兩者之間沒有相關性，結果可能受樣本數據及操作手法、試劑盒敏感程度的影響，我們還需要進一步的驗證與考量。

3 討論

SCI常引起損傷平面以下感覺、運動、反射減弱或消失，植物神經功能紊亂，大小便失禁及性功能障礙，造成患者嚴重病廢。患者有時影像學檢查上表現輕，脊髓外觀上保持完整并且連貫，但卻出現喪失大部分或者全部脊髓功能的癥狀，甚至產生嚴重后遺癥。現階段，對病人進行正確的神經系統體格檢查，參考影像學等輔助檢查，可以診斷出脊髓是否受損。但是在早期判斷其損傷的程度仍有一定困難，其手術適應征在選擇上尚不非常明確和嚴謹，葉春平通過研究后認為，在無骨折脫位型頸髓損傷中，JOA評分輕、中度患者可不必早期進行手術治療。洪毅等倡導進行手術治療，觀點是通過手術才能夠對遠期脊髓功能的恢復情況有積極的影響。由此可見手術與否的選擇爭議很大。當前大多數學者認為，短期內神經功能無明顯恢復或恢復不滿意者可有手術指征。手術與否及手術時間的掌握常常困擾著醫療工作人員，對病情發展的準確評估仍是一個較大的難題。所以最好出現一個指標用來協助我們準確地辨別脊髓損傷程度、恢復狀況和依據具體損傷來決定診療方案，避免病情進一步發展或惡化。

在分辨脊髓損傷程度方面，改良SEP檢測優勢明顯。其潛伏期的存在及時間長短可判定被測試感覺纖維的傳導功能，傳導功能異常可使潛伏期時間延長。其波幅的大小則代表了受測神經纖維產生同步放電神經元的量的多少。本實驗為判定脊髓損傷程度的可信度和脊髓損傷的恢復情況，采用改良SEP檢測方法。正常血液中NSE含量極微，約3～8ng/mL[8]。NSE與乳酸脫氫酶、醛縮酶、肌酸激酶不同，它不與細胞內肌動蛋白結合，因而很容易釋放出來。國內秦凱[9]在大鼠急性SCI后通過對血漿中NSE的定量分析發現其會明顯增高，能夠客觀的監測脊髓損傷嚴重情況。經大量實驗證明，S-100β

參與神經元損傷病理機制和重塑機制，可體現、反映神經元的完整性。在形態方面因為S-100β分子量小，容易通過屏障，可較易測得。在模型成功后探討用臨床上容易獲取的血清，通過對其中NSE及S-100β的測定來揭示大鼠脊髓損傷情況及恢復程度。

本實驗研究發現，在正常大鼠血清中存在微量NSE和S-100β；一定損傷程度范圍內，隨著損傷程度的增進，大鼠血清中NSE和S-100β表達有所升高，且與脊髓損傷的程度呈正相關，即：隨著程度的不斷加大，NSE和S-100β的陽性表達結果逐漸增多；大鼠脊髓損傷后6h的陽性表達量到達最大值，明顯高于對照組。可認為NSE和s-100β能夠作為檢測脊髓損傷嚴重程度的一個指標，進一步為臨床研究方向提供一種新見解。 從本文數據分析，我們可以認為當大鼠血清中NSE含量大于6.26ng/mL時可能出現了脊髓的損傷，這有一定意義存在。NSE和S-100β兩者在研究中發現不具有相關性，這還需要我們進一步的探索。

本文實驗亦存在不足之處，樣本數量不夠龐大，實驗手法及技巧仍需要加強，同時，鑒于資金等局限因素，未能進行大數據統計，本實驗在統計72h組時因樣本丟失過大，統計可信性降低，未予以采用，因而還需要以后進行更具代表性的實驗驗證。

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[2]鄧曉冬,李躍輝,鐘曉.脊柱爆裂性骨折伴脊髓損傷患者圍術期血清炎性與神經功能指標的變化[J].海南醫學院學報,2014,20(5):670-672,676

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[4]KonstantinouEA,VenetsanouK,MitsosAP,etal.NeuronspecificenolaseNSE:avaluableprognosticfactorofcentralnervoussystemdysfunctionfollowingcardiacsurgery[J].BritJAnaesthetRecNur,2008,19:22-28

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[7]宿獻偉,周成福,馬曉茹.大鼠急性脊髓損傷早期Rab3a的表達[J].黑龍江醫藥學,2012,35(4):38-39

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1.2016年佳木斯大學研究生科技創新項目,編號：YM2016_026；2.黑龍江省教育廳科研項目，編號：12531717。

王崇禧(1987～)男,山東沂水人,在讀碩士研究生。

周成福(1964～)男，黑龍江佳木斯人,碩士，主任醫師,教授，碩士研究生導師。E-mail:3534478470@qq.com。

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1008-0104(2017)03-0047-03

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