β磷酸三鈣/膠原對骨髓間充質干細胞成骨活性的研究①

丁 義,趙 剛

(佳木斯大學附屬第二醫院正畸科，黑龍江 佳木斯 154000)

β磷酸三鈣/膠原對骨髓間充質干細胞成骨活性的研究①

丁 義,趙 剛

(佳木斯大學附屬第二醫院正畸科，黑龍江 佳木斯 154000)

目的：研究β磷酸三鈣/膠原支架對骨髓間充質干細胞成骨活性的影響。方法：支架材料與骨髓間充質干細胞復合培養，作為實驗組。7、14、21d分別進行MTS、ALP檢測，與無支架材料的對照組進行比較。結果：實驗組與對照組細胞數量都逐步增加，實驗組數量稍多于對照組，但兩組差異無統計學意義(P>0.05)；兩組ALP活性都有所增強，且實驗組較對照組顯著增加，具有統計學意義(P<0.05)。結論：支架材料在體外環境對細胞增殖無不利影響，且能提高骨髓間充質干細胞成骨活性。

支架材料；骨髓間充質干細胞；成骨

β磷酸三鈣/膠原復合物的是一種較理想的骨質缺損修復重建材料。EijiK[1]利用該材料充填直徑5mm的大鼠顱骨并獲得了理想的修復效果，展示了復合物支架的良好的生物相容性。骨髓間充質干細胞，在適宜的誘導條件下可定向分化為多種細胞，其中包括成骨細胞，在創傷部位植入骨髓間充質干細胞與支架材料的復合物，被認為是現今最好的修復骨缺損的方法之一[2]。β磷酸三鈣/膠原復合支架的體外研究相對較少，可能與體外實驗中培養液的浸泡使材料的物理狀態改變有關。本文通過骨髓間充質干細胞與支架材料復合的體外實驗，探究支架材料對骨髓間充質干細胞的影響。

1 材料

1.1 主要材料

4～6周齡小鼠，佳木斯大學動物實驗中心提供。DMEM培養基(HyClone)，胎牛血清(HyClone)，地塞米松、β一甘油磷酸鈉、維生素C(均為Gibco公司)，胰蛋白酶(HyClone)，MTS試劑盒(Boster博士德生物)，堿性磷酸酶試劑盒(購自南京建成)。β磷酸三鈣/膠原復合支架購自暨南大學生物醫學工程研究所。

1.2 主要儀器設備

CO2恒溫細胞培養箱(美國ThermoForma)，超凈工作臺(蘇州明泰空氣凈化技術有限公司)，電子分析天平(Ohaus，美國)，倒置相差顯微鏡(Olympus，日本)，酶標儀(Takara，日本)。

2 方法

2.1 骨髓間充質干細胞的分離與培養

無菌條件下分離出小鼠的股骨，剪去兩側骺端，顯露髓腔，用1mL注射器吸取培養液(10%胎牛血清，1%雙抗，1%谷氨酰胺，88%L-DMEM)沖洗髓腔，直到骨面發白。將細胞轉移到15mL離心管中，1500r/min離心10min，棄掉上清液，加入培養液5mL，混勻后接種于培養瓶，置于37℃、CO2體積分數5%的培養箱內培養，48h后換液，去除懸浮未貼壁的細胞，以后每2天更換培養液。細胞達到80%融合以上時，加入0.25%的胰蛋白酶進行消化，按1:2比例傳代。

2.2 細胞接種

將材料切割成5mm×5mm×2mm小長方體，紫外線照射消毒滅菌30min；使用培養液5mL浸泡支架10min，傾倒出培養液，重復3次。將5×104個骨髓間充質干細胞與支架材料復合培養于24孔板，對照組不含支架材料，實驗組與對照組均添加成骨誘導液(0.1μmol/L地塞米松、50μg/mL維生素C、10mmol/Lβ—甘油磷酸鈉)。放入37℃、CO2體積分數5%的培養箱，48h換液一次。

2.3MTS法檢測細胞增殖

在分別培養7、14、21d后，棄掉材料和培養基。實驗組和對照組每孔均加入60μLMTS液，在培養箱中孵育4h后棄上清，每孔加入600μLDMSO液，輕輕吹打使溶液均勻并按每孔150μL將溶液轉移至96孔板中，利用分光光度計在波長為492nm測出吸光度值。

2.4 堿性磷酸酶活性(ALP)測定

在培養7、14、21d后按照ALP試劑盒操作進行檢測。

2.5 統計學方法

3 結果

3.1MTS檢測細胞增殖

由表1可見，隨著時間增加，兩組細胞數量都增加，且實驗組數量稍多于對照組，但與對照組相比無統計學差異(P>0.05),說明支架材料未影響細胞正常增殖，可能有利于細胞增殖。

表1 支架材料對BMSCs增殖的影響

3.2 堿性磷酸酶活性測定

由表2可見，隨著時間增加，兩組堿性磷酸酶活性都增加，且實驗組較對照組增加的明顯更多，第7天組測量值具有統計學意義(P<0.05)，實驗組堿性磷酸酶活性在第14天與第21天較對照組增加顯著，且具有統計學意義(P<0.01)。說明β磷酸三鈣/膠原支架材料對骨髓間充質干細胞的成骨活性促進作用較顯著。

表2 支架材料對堿性磷酸酶活性的影響±s，n=24)

4 討論

口腔正畸中的牙齒移動一方面來源于牙骨質本身在壓力環境中能保持不吸收，維護了牙齒的結構完整，一方面則是牙槽骨受壓后吸收并在張力側迅速增生重建，維護了牙齒移動后的位置不變，所以骨組織工程的進展一直是正畸醫生關注的。組織工程中，常使用三維支架支撐缺損部位，隨著支架的降解新生組織獲得再生的空間同時修復的潛能得以激發[3]。生物活性陶瓷中的磷酸三鈣具有生物活性和骨傳導作用, 但存在成形不理想、強度低、韌性差等缺點[4]。骨膠原常作為黏合劑與具備骨傳導能力的載體如磷酸三鈣合用[5]，使其與人骨接近，可提高骨修復效果。骨髓中的間充質干細胞具有取材方便，體外分離培養較容易，且自體獲取回輸后免疫排斥反應較小以及不受倫理限制等優點，被認為是組織工程的重要種子細胞[6,7]負載骨髓間充質干細胞制備成復合人工骨材料，使支架材料既具有骨傳導作用，又具有骨誘導作用[8]。近年來圍繞骨髓間充質干細胞的研究越來越多[9,10]。

國內近幾年關于磷酸三鈣/膠原支架的研究集中于體內研究。本實驗在體外環境中評估支架材料對干細胞的影響，實驗組與對照組細胞數量隨時間均有所增加，而且實驗組的數量較對照組稍大，但兩組間各時間段細胞數量無統計學差異(P>0.05),提示支架材料的應用并不會影響細胞的正常增殖而可能有利于其生長。在ALP活性方面，實驗組和對照組均有增加，且實驗組測量值均大于對照組，在第7天組兩組測量值存在統計學差異(P<0.05)，第14天組和第21天組實驗組測量值顯著大于對照組，具有統計學差異(P<0.01)，表明β磷酸三鈣/膠原支架材料的存在對骨髓間充質干細胞成骨有明確的促進作用。需要注意的是，在實驗過程中，個別組中支架材料變軟、結構變得松散。一方面考慮其本身成分可降解，且在體內實驗中隨著新生組織的修復而被吸收，變軟及松散是不斷降解的正常現象；一方面考慮在換液操作過程中，反復的液體沖擊可能造成材料受力斷裂變形。國外的研究側重于細胞-支架系統機械性能改變的基礎研究，證實了復合物彈性模量的改變確實存在，對復合物進入人體后強度的改變具有指導作用，目前尚沒有更多關于支架機械性能改進的研究結果。總之，由單一組分的支架材料到多成分的配伍，由支架材料自身到負載細胞、基因的新組合，發展迅速的組織工程為骨缺損修復提供了很大的空間；體內體外實驗均對材料的檢驗有重要的意義，相輔相成，全面認識材料必須是在多方面實驗的基礎上開始的。目前，仍需要積極的臨床試驗來確定療效以及長期效果。

[1]EijiK,JefferyL,KaoruS,etal.Biodegradationpropertyofbeta-tricalciumphosphate-collagencompositeinaccordancewithboneformation:acomparativestudywithBio-OssCollageninaratcritical-sizedefectmodel[J].ClinImplantDentRelatRes, 2014, 16(2):202-211

[2]李煥萍, 劉春蓉, 張永亮. 骨髓間充質干細胞在醫學領域中的研究與應用[J]. 中國組織工程研究與臨床康復, 2007, 11(28):5622-5625

[3]陳欣, 張春林. 組織工程骨修復骨缺損的研究進展及臨床應用[J]. 中國組織工程研究, 2010, 14(24):4486-4490

[4]陳美雄. 復合材料人工骨在骨缺損修復中的應用[J]. 中國組織工程研究, 2007, 11(48):9797-9800

[5]郭宜姣, 李文華. 骨缺損修復生物工程研究進展[J]. 中國骨質疏松雜志, 2014(08):988-993

[6]KruytMC,DhertWJA,OnerFC,etal.Analysisofectopicandorthotopicboneformationincell-basedtissue-engineeredconstructsingoats[J].Biomaterials, 2007, 28(10):1798-805

[7]DePeppoGM,SjovallP,LennersM,etal.Osteogenicpotentialofhumanmesenchymalstemcellsandhumanembryonicstemcell-derivedmesodermalprogenitors:atissueengineeringperspective[J].TissueEngPartA，2010，16(11):3413-3426

[8]張志宏, 劉志禮, 高志增,等. 骨修復替代材料修復骨缺損的選擇與應用[J]. 中國組織工程研究, 2012(52):9836-9843

[9]張立超, 賀濤, 帥逸,等. 正常大鼠的骨髓間充質干細胞對去勢大鼠骨髓間充質干細胞成骨成脂分化的影響[J]. 黑龍江醫藥科學, 2016, 39(2):93-95

[10]趙力, 張雪松, 劉程偉,等.PDGF-B基因轉染骨髓間充質干細胞的實驗研究[J]. 黑龍江醫藥科學, 2005, 28(6):16-17

Effect of theβ-TCP/Col composite to BMSCs in bone formation activity

DINGYi,ZHAOGang

(Orthodontic Department, The Second Affiliated Hospital of Jiamusi University, Jiamusi 154002,China)

Objective：Purpose study effect of theβ-TCP/Col composite to BMSCs in bone formation activity. Methods: The BMSCs were cultured with materials as experimental group while the control group with no materials. Tests were taken about MTS, ALP on the 7th, 14th and 21th day. The two groups were compared. Results：Cell numbers and ALPs increased in both groups while there’s no difference in math about MTS, but experimental group showed higher ALPs. Conclusion：The effect of the β-TCP/Col composite to BMSCs in bone formation activity is positive, and no negative influence was found in cell proliferation .

materials；BMSCs；bone formation

黑龍江省自然科學基金，編號：H201487。

丁義(1990～)男，河北張家口人，在讀碩士研究生。

趙剛(1975～)男，黑龍江依蘭人，碩士，副主任醫師，副教授，碩士研究生導師。E-mail:13504545575@126.com。

R

B

1008-0104(2017)03-0012-02

2016-12-05)