棉花microRNA功能研究進展

劉玉姣，裘波音，王汐妍，徐曉建，祝水金，陳進紅，*

(1.浙江大學 農業與生物技術學院/浙江省作物種質資源重點實驗室，浙江 杭州 310058； 2.溫州科技職業學院，浙江 溫州 320056)

棉花microRNA功能研究進展

劉玉姣1，裘波音2，王汐妍1，徐曉建1，祝水金1，陳進紅1，*

(1.浙江大學 農業與生物技術學院/浙江省作物種質資源重點實驗室，浙江 杭州 310058； 2.溫州科技職業學院，浙江 溫州 320056)

MicroRNAs(miRNAs)是一類重要的基因表達調節因子，在植物生長發育、逆境脅迫應答等方面起到重要作用。隨著深度測序技術的廣泛應用，棉花(Gossypiumhirsutum)中miRNAs的功能探究成為目前的研究熱點。文章主要綜述了miRNAs在棉花生物和非生物逆境應答、纖維發育、形態建成方面的功能，并對今后的發展方向和重點作了展望。

miRNAs；棉花；逆境脅迫；纖維發育

MicroRNAs(miRNAs)是一類具有調控功能的內源非編碼單鏈小分子RNA，長度一般為20～24 bp，通過堿基互補配對的方式識別靶標mRNA，通過誘導靶基因的切割降解或抑制翻譯來調控靶基因的表達[1]。植物中miRNAs前體(primary miRNA，pri-miRNA)由RNA聚合酶II(PolII)轉錄而來，折疊成發夾狀的次級結構(即發夾或者莖環狀)，在細胞核內經過DICER-LIKE1 (DCL1)的2步連續切割形成miRNA/miRNA*雙螺旋產物[2]。DCL1加工后，miRNA/miRNA*雙螺旋產物被輸送到細胞質中，其中，miRNA與ARGONAUTE(AGO)家族蛋白結合，形成RNA誘導的沉默復合體(RISCs)，miRNA*則被降解。miRNA與mRNA靶標序列的完全或近乎完全的互補配對，抑制了mRNA的翻譯或使其降解，從而調控靶基因的表達[3]。作為真核生物基因表達的主要負調控因子，miRNAs廣泛存在于植物基因組中，研究表明，miRNAs可以在轉錄水平、轉錄后水平和翻譯水平廣泛地參與植物的生長發育、逆境生理及信號轉導等重要過程[4]。目前為止，采用高通量測序技術、miRNA微陣列技術及實時熒光定量PCR等方法已經鑒定出許多與棉花生長發育及生物、非生物脅迫有關的miRNAs，但對其生物學的功能研究還有待深入。

1 棉花miRNA的研究方法

2005年，Zhang等[5]利用EST分析技術首次在雷蒙德氏棉中鑒定出4個miRNAs(miR157、miR160、miR171和miR172)。2008年，Barozail等[6]采用比較基因組的方法從棉花中鑒定獲得22個miRNAs。同年，Abdurakhmonov等[7]采用直接克隆技術從棉花中鑒定出3個miRNAs(miR172、miR390n和miR853)。2012年，Wang等[8]從來自于41 781個亞洲棉ESTs中識別出73個miRNAs，分別屬于49個不同的miRNAs家族。但鑒于當時有限的基因組序列，未能識別出保守的miR159和miR162。隨著深度測序技術的發展及應用，Gong等[9]從雷蒙德氏棉的幼苗葉片中找到127個保守的miRNAs，極大地豐富了棉花miRNAs數據庫。雖然采用深度測序技術發現了大量的miRNAs，但大多數的miRNA靶基因尚不明確。基于植物中miRNA與mRNA完全或近乎完全的配對的原則，降解組測序(一種結合生物信息學分析、cDNA末端快速擴增技術和高通量測序技術優勢的方法)開始應用于miRNA靶基因的檢測，這有助于確認上游miRNA的剪切基因，從而獲知下游影響基因的路徑，對miRNAs靶基因的功能有準確和深入的研究[10]。

2 棉花miRNAs與逆境脅迫

棉花面臨的逆境脅迫主要包括2個方面，其一是非生物脅迫，比如鹽脅迫、干旱、冷害、氧化應激壓力、重金屬及營養富集；其二是生物脅迫，包括病害與蟲害[11]。

2.1 棉花miRNAs對非生物脅迫的應答

鹽脅迫和干旱是分布最廣和影響最大的2種非生物脅迫因素，在很大程度上影響了棉花的生長發育，導致棉花品質和產量的下降。研究表明，大部分非生物脅迫應答基因被復雜的轉錄因子調控[11]。MiR160在多種植物發育過程包括幼苗和胚胎發育、花序形成方面有重要的作用。早期研究證實miR160b/c可能通過靶標ARF(auxin response factor)參與棉花幼苗對鹽和干旱脅迫的抗性過程[12]。為了進一步探究miRNA在棉花耐鹽性方面的作用，Yin等[13]采用miRNA微列陣技術檢測了耐鹽品種SN-011和鹽敏感品種LM-6中miRNAs的差異表達，發現在高鹽脅迫下，耐鹽品種中miR156a/d/e、miR169、miR535a/b和miR827b表達下調，而鹽敏感品種中只有miR159表達下調。這些miRNAs的下調引起靶基因的積累，促進棉花對鹽脅迫的適應，說明這些miRNAs及其靶標在棉花響應鹽脅迫過程中作用顯著。在鹽處理下，一些miRNAs及其靶基因表現出劑量效應和組織特異性[13]。Xie等[12]對鹽脅迫、干旱和正常3個條件下，棉花幼苗期的small RNA文庫進行測序，識別出267個保守的miRNAs及75個新miRNAs，其中miR1868和miR2099分別只能在干旱和鹽脅迫條件下表達。Wang等[14]以TM-1種子為材料，用不同濃度的NaCl溶液處理，發現miR397在葉片中的表達量是根中的131.6倍；葉片和根中的miR156-SPL2、根中的miR159-TCP3和miR162-DCL1的表達趨勢相反，表明這些miRNAs及其靶標在鹽處理下表現出劑量效應和組織特異性，從而響應逆境脅迫過程。

低溫和高溫脅迫也是影響植物生長發育的2個最重要的環境因素，Wang[15]發現陸地棉中miR397-5p和miR8767c僅在高溫處理(35 ℃)下表達，miR8779、miR169h-3p和miR7484c僅在低溫處理(4、12 ℃)下表達。同時，轉錄因子在miRNAs調控下可能在植物對溫度脅迫的耐性方面起著重要作用。高溫下，MYB在miR828a和miR858靶向調控下上調表達，4 ℃時miR166k靶向下調HD-ZIP，表明miRNAs可以通過調控相應靶基因來維持溫度脅迫下棉花的正常生長。

棉花是一種相對耐金屬脅迫的植物，miRNAs在棉花對重金屬脅迫響應方面也起重要作用[16]。研究表明，重金屬脅迫會顯著改變棉花中miRNAs及其靶標的表達模式。He等[16]發現陸地棉在鉛處理下，葉片中miR159、miR162、miR167、miR395、miR396顯著上調，miR156、miR398、miR399、miR414、miR833a、miR5658的表達受到抑制，miR172-AP2、miR172-MYB68、miR159-TCP、miR833a-RAX2、miR156-SPL、miR396-GRF表現為負調控，說明miRNAs可通過負向調控相關靶基因在棉花重金屬脅迫方面起作用[16]。

由于miRNAs的表達水平在不同脅迫條件下有顯著變化，因此，在不同物種中直接比較相同miRNAs的表達水平結果并不一定可靠[14]。對miRNAs在植物耐性方面的研究應該基于不同濃度的脅迫處理，以增強結果的可靠性。盡管在棉花中識別出很多與非生物逆境相關的miRNAs(表1)，但是控制基因表達的調控機制仍然有待進一步研究，以獲得更有效的途徑來增強棉花植株的抗逆性，提高棉花的產量和品質。

2.2 棉花miRNA對生物脅迫的應答

與棉花黃萎病和卷葉病有關的miRNA見表2。棉花黃萎病是由大麗輪枝菌(Verticilliumdahlia)侵染引起的真菌性土傳病害，棉花感病后表現出葉片皺縮、壞死、落葉、莖桿枯萎等癥狀，嚴重影響棉花的產量和品質[12]。研究表明，大量的miRNAs及其他小的非編碼RNAs參與陸地棉和海島棉對大麗輪枝菌侵染的防御反應，而且陸地棉與海島棉在感染黃萎病之后，很多miRNAs表現出了物種表達特異性[17]。為了篩選出棉花中黃萎病相關的miRNAs，2015年，張玉娟等[18]采用生物信息學方法，結合已報道的文獻，找到64個與黃萎病相關的miRNAs，隨機選取12個miRNAs進行實時熒光定量PCR檢測，發現12個miRNAs在棉花根中的相對表達量降低，其中，miR158a、miR399a和miR7485的相對表達量顯著降低，說明這12個miRNAs都能夠對黃萎病侵染做出響應。該研究豐富了棉花中黃萎病抗性相關的miRNAs，為之后的研究提供了基礎。NBS(nucleotide binding site)-LRR(leucine-rich repeat)，是一種抗病基因[19]，陸地棉感染黃萎病之后，miR482通過靶向上調NBS-LRR來對黃萎病侵染做出防御反應[19]。Zhang等[20]結合高通量和降解組測序技術分析了miRNAs及其靶基因在陸地棉和海島棉接種黃萎病之后的應答情況，發現miR482a在海島棉中的表達比在陸地棉低，說明有些miRNA有物種表達特異性，推測這些miRNAs可通過調控相關靶基因來調節植株對黃萎病的抗性，具體的調控機制還需做進一步研究。當耐病品種Hai-7124和感病品種Yi-11的根接種黃萎病后，棉花miR862和miR1536的表達量顯著下降，而靶基因TCH4表達上調，表明miR862和miR1536通過靶標TCH4對病害防御發揮作用[17]。因此，對miRNA抗逆功能的研究可為棉花黃萎病抗性育種提供一定的理論基礎。

表1 與棉花非生物脅迫相關的miRNAs

Table 1 Abiotic stress related miRNAs in Cotton

序號No.miRNAs可能靶標Targetgenes參考文獻References123456789101112131415161718192021222324252627miR156miR157miR159miR160miR162miR164amiR165miR167amiR168miR169miR172miR393miR395miR396miR397miR398bmiR399amiR447amiR5255miR156miR159miR164miR172miR396miR399miR414miR833aSPL2SPLTCP3ARF6DCL1NACREVARF6,ARF8AGO1NF-YA3AP2F-BOX3,TIR1APS1GRF1LACCu/ZnSODsBIT1CPC(MYB)CPC(MYB)SPL2TCPCUCAP2,MYB68GRF,RAX3BIT1RAX1RAX2[14][12][13][14][13][12][14][13][12][12][14][12][14][14][13][12][12][12][12][16][16][16][16][16][16][16][16]

表2 與棉花黃萎病和卷葉病有關的miRNA

Table 2 Verticillium wilt and leaf curl disease related miRNAs in cotton

序號No.miRNAs可能靶標Targetgenes參考文獻References1234567891011121314151617181920212223miR156miR157miR164miR166miR172miR390miR393miR394miR395a/dmiR396miR400amiR408miR781miR841miR482miR843miR862miR1536miR2111bmiR2118amiR2949miR2950miR8170-3pSPLAC2NAMHD-ZipAP2-likeTAS3TIR1AC1和AC4AC1和AC4GRFPPRAC1和AC2GDRP-19RAV-likeNBS-LRRUnknownTCH4TCH4F-boxNBS-LRRAC1CLCrVNBS-LRR[20][22][20][20][20][17][17][12][12][14][12][22][23][23][19][23][17][17][23][23][22][22][16]

棉花感染卷葉病病毒(CLCrV，leaf curl disease virus)會造成卷葉病。CLCrV由2個環狀單鏈DNA組成，DNA-A和DNA-B，DNA-A包括AV1、AC1、AC2、AC3和AC4，DNA-B包括BV1和BC1[21]。Shweta等[22]首次發現陸地棉中miRNAs靶標CLCrV基因，miR2950能靶標CLCrV中所有的基因，miR408靶標AC1和AC2基因，miR394、miR395a和miR395d能夠與AC1和AC4基因結合，通過下調棉花卷葉病毒基因表達來增強植株對病害的抗性，證實這些miRNAs可能在抗卷葉病的第1道防線上起重要作用。

2.3 棉花miRNAs對纖維發育的調控

棉纖維發育主要有4個時期，包括纖維起始、伸長、細胞壁初始形成和成熟[24]。早在2001年，就有研究表明miR396以胼胝質合酶(CFL1，AF085717)為靶標，調控纖維發育[25]。在挖掘植物miRNAs的過程中，陸續發現了一些在棉纖維發育過程中特異表達的miRNAs，并進一步預測其靶基因(表3)。Zhang等[26]采用比較基因組學的方法鑒定出30個棉花miRNAs，用qRT-PCR檢測miR156、miR162、miR172和miR396在子葉、果枝嫩葉、花蕾、胚珠(0DPA)、胚珠(+2DPA)、花瓣(0DPA)、纖維(+20DPA)、雌蕊與心皮(0DPA)混合物8個棉花器官中的表達水平，發現miR396在8個棉花器官中均表達，包括纖維和胚珠，表明miR396在棉花纖維分化和發育中起重要作用。Naoumkina等[27]對Ligon-lintless-1(Li1)、Ligon-lintless-2(Li2)突變體和野生型8DPA的胚珠進行small RNA測序，發現短纖維突變體中的miR159表達量較高，NAC-TF (Gh_D11G0347)被預測為miR164的靶標，miR164在Li1和Li2纖維細胞中顯著上調，靶標NAC-TF下調，這表明miR159和miR164在纖維發育方面起重要作用。有研究發現海島棉miRNA156/157在棉纖維發育中起一定的作用[28]，而Naoumkina等[27]的研究卻顯示miR156/157在短纖維突變體與野生型發育纖維中的轉錄豐度沒有顯著差異，推測miR156/157很大程度上不參與纖維的縮短的原因是Li1和Li2是野生棉近等位基因的2個短纖維突變體。

生長素在棉花纖維起始過程的作用可能跟IAA的積累有關[29]。Zhang等[30]發現miR160、miR394、miR397、miR398、miR482、miR2111的表達水平顯著上調，且在纖維和胚珠發育期間的表達呈動態變化。miR160和miR167都以生長素響應因子(ARF)為靶標，參與纖維的發育過程[31]。miR166主要在棉花幼胚珠和纖維中高度表達[24]，miR167在棉纖維伸長中起關鍵作用的表達主要集中在纖維細胞發育時期(5DPA到20DPA)[32]，miR156/157家族在纖維伸長中也起到了重要作用，抑制其表達會導致成熟纖維長度下降[28]。MYB2基因與擬南芥中GLABROUS1(GL1)在表皮毛形成中的功能相似，Guan等[11]證實MYB2可能是陸地棉纖維細胞發育時期miR828和miR858的主要靶標。因此，miR828和miR858在棉花纖維發育方面也起到重要作用。miRNAs在棉纖維發育方面的研究有助于通過分子育種的方法提高棉纖維產量，而棉纖維發育的分子機制將是之后的研究重點。

表3 與纖維發育相關的miRNA

Table 3 Fiber development related miRNAs in cotton

序號No.miRNAs可能靶標Targetgenes參考文獻References123456789101112131415161718192021miR156miR157miR159miR160miR162miR164miR165/166miR167miR169miR170/171miR172miR319miR390miR393miR394miR396miR399miR414miR782miR828miR858SPL9SBPF-boxARF10DCL1NAC-TFClassIIIHD-zipARF6,8HAP2SCL6AP2/AP2-likeTCP4TAS3-likeTIR1F-boxCFL1MYBfiberproteinFb23fiberquinineoxidoreduc-taseMYB2MYB2[8][6][8][6][26][28][6][32][32][8][32][8][6][8][8][25][8][33][33][11][11]

3 miRNA參與棉花發育調控的其他研究

矮化栽培在植物育種、生長和發育方面起到重要作用，矮化棉具有更強的對抗風和雨的能力，與棉花產量穩定增加有緊密聯系[34]。研究表明，miR160通過靶標ARF參與植物的生長發育過程[6]。An等[34]對陸地棉矮桿突變體、高稈突變體和野生型的葉片進行轉錄組和small RNA測序，發現miR160在矮稈突變體中上調，在高稈突變體中下調，表明miR160通過靶標ARF負調控棉花的株高發育；MiR166及其靶標在植物生長過程中起重要作用，包括頂端發芽和側分生組織的形成、葉片極性、花發育和維管組織發育[35]。細胞色素P450是miR172的靶標，An等[34]證實miR172在矮稈和高稈突變體中表達水平均較高，推測miR172可能通過靶標細胞色素P450調控棉花株高。細胞色素P450也是棉花特異miR2948-5p的靶基因[35]，因而細胞色素P450家族是棉花多個miRNAs的靶標，調控多種生物學過程和生長發育。

目前，棉花果枝和花芽發育時期的分子機制仍不清楚。Sun等[36]對陸地棉和海島棉的mRNA和miRNA的表達進行了測定，結果表明，相較于海島棉，現蕾前陸地棉中miR156c-3p、miR156i-3p、miR171c、miR156和miR171特異表達，說明棉花的果枝發育可能與開花轉型相關。miRNA能夠調控植物生長發育過程中器官從營養生長到生殖生長的形態轉變[37]。2009年，Zhang等[26]研究發現，miR172通過靶標AP2在棉花花器官發育中起關鍵作用。靶標的變異也會對植株的生長發育造成影響，如miR167靶基因作用位點ARF6或ARF8的突變，導致珠被發育停滯或胚珠不育[33]，這從另一方面說明miR167在棉花胚珠和花藥生長發育過程中不可缺失。雷蒙德氏棉中miR164在花蕾和嫩枝中都有較高的表達水平[4]，所以miR164不僅與花器官發育相關，也可能在嫩枝發育中起重要作用，這一發現有助于對棉花miRNAs的功能特性進行更深入的研究。

4 展望

目前，隨著分子生物學和生物信息學的不斷發展，miRNA的研究越來越深入，主要采用直接克隆法、比較基因組學、深度測序和qRT-PCR對棉花miRNA進行鑒定和驗證，采用靶基因預測軟件和降解組測序分析鑒定靶基因。很多研究人員嘗試去研究棉花生長和發育的調控機制，同時嘗試通過傳統育種和現代分子育種相結合的途徑去提高棉花產量和品質，以增強棉花對環境脅迫的適應。盡管之前有對棉花miRNAs識別、表達和功能預測的研究，對棉花miRNA156/157、miR159、miR160、miR166、miR172、miR393研究較多，但相關研究仍停留在初始階段，對其調控機制仍需進一步探究。

miRNAs可能參與鹽、干旱等多種交叉信號途徑，這為研究miRNAs介導基因調控提供了新的視野。比如，Xie等[12]證實miR160b/c可能靶標ARFs參與了棉花幼苗發育和幼苗對鹽和干旱脅迫的抗性過程。在鹽和堿的作用下，miR393上調會擴大棉花中的脅迫信號，通過信號轉導，與生長素有關的途徑激發了其他途徑來應對外界的干旱和脅迫。相關研究發現miR447a和miR5255可能以CPC(MYB轉錄因子)為靶標，通過調控CPC，在棉花根對干旱和鹽脅迫的響應或者纖維發育中起重要作用，表明miRNAs的靶標基因不僅僅與棉花干旱和鹽脅迫響應相關，也參與了棉花纖維的發育，在棉花復雜的調控系統中發揮著重要作用[12]。

ARFs參與了植物生長素信號調控，在植物生長發育和對外界環境的應答方面起了重要作用，如擬南芥miR393，通過調控生長素信號能夠對丁香假單胞桿菌侵染進行基礎防御[38]，表明miRNAs介導的生長素信號在疾病抗性方面也有一定作用。目前，已經發現了眾多在棉花生長發育過程中表達或特異表達的基因，并初步研究了這些基因的功能，但是鑒定和克隆出的miRNAs數量非常有限。因此，對miRNAs介導的棉花對環境的應答、纖維發育等方面的調控機制需要進行深入的研究，這將有助于了解miRNAs在非生物脅迫應答、抗病性及棉纖維發育方面的作用，為提高纖維產量和品質提供有效途徑。

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(責任編輯 侯春曉)

Advance of research on microRNA function in cotton (Gossypiumhirsutum)

LIU Yujiao1， QIU Boyin2， WANG Xiyan1， XU Xiaojian1， ZHU Shuijin1， CHEN Jinhong1，*

(1.CollegeofAgricultureandBiotechnology，ZhejiangUniversity/ZhejiangKeyLabofCropGermplasm，Hangzhou310058，China; 2.WenzhouVocationalCollegeofScienceandTechnology，Wenzhou320056，China)

MicroRNAs (miRNAs) are important regulators of gene expression， and play essential roles in plant growth and development， response to adversity stress， etc. With the extensive application of deep sequencing technology， the function of miRNAs in cotton (Gossypiumhirsutum) miRNAs has become a hot research topic. In this paper， the function of miRNAs in response to biotic and abiotic stress， fiber development and morphogenesis were reviewed. Eventually， the future research direction and emphasis were looked forward.

miRNAs; cotton (Gossypiumhirsutum); adversity stress; fiber development

10.3969/j.issn.1004-1524.2017.06.27

2016-11-26

國家自然科學基金項目(31571715)

劉玉姣(1991—)，女，湖南湘西人，碩士研究生，從事作物品質形成與調控研究。E-mail: liuyujiaohz@163.com

*通信作者，陳進紅，E-mail: jinhongchen@zju.edu.cn

S562

A

1004-1524(2017)06-1050-07