紅顏草莓脫毒優化及病毒檢測的研究

陳 英，肖春林，羅燕娜，張西英，劉江娜

(新疆生產建設兵團第六師農業科學研究所，新疆 五家渠 831300)

紅顏草莓脫毒優化及病毒檢測的研究

陳 英，肖春林，羅燕娜，張西英，劉江娜

(新疆生產建設兵團第六師農業科學研究所，新疆 五家渠 831300)

以紅顏草莓品種為材料，采用無菌瓶苗，經高溫處理、冰點低溫處理結合莖尖剝離脫毒，并用血清學中的雙抗體一步夾心酶聯免疫法檢測4種病毒的方法，對細胞分生組織誘導分化成苗的成活率高低和脫毒效果進行比較。結果表明，采用-1 ℃低溫處理結合莖尖剝離長度由0.3 mm增加到0.5 mm，誘導分化苗的成活率由23.0%大幅度提高到39.6%～60.0%，再通過雙抗體夾心酶聯免疫法檢測病毒，4種病毒全部脫除。

草莓；溫度；莖尖脫毒；病毒檢測；優化

草莓(Fragaria×ananassaDuch.)是籬蔽科(Rosaceae)草莓屬(Fragaria)宿根性多年生常綠草本植物，因果實顏色鮮艷、肉質細嫩、柔軟多汁、甜酸適口和風味獨特而深受消費者喜愛[1]。近年來，新疆設施草莓進入了快速發展期。草莓一般以無性繁殖方式為主，易感染病毒，且多為潛隱性病毒，易造成復合侵染，嚴重影響植株長勢，使果實品質和產量下降，嚴重時減產可高達75%[2]。草莓病毒病會隨著其營養繁殖代代相傳，目前尚無特效的藥劑或方法；因此，運用生物技術對草毒進行脫毒[3-4]和病毒檢測并培育和推廣使用脫毒苗是解決問題的關鍵。據報道，脫毒草莓苗的過氧化氫酶(CAT)、過氧化物酶(POD)活性均高于常規苗，有利于改善植株正常代謝活動、恢復種性、提高產量和品質、增強抗逆性[5]；同時，也可有效減少農藥的使用量，為生產綠色無公害優質草莓果品提供了良好保障，有助于草莓產業的健康持續發展。

用熱處理結合莖尖培養法進行無病毒苗的培育，是目前世界上獲得草莓無毒苗最普通且最有效的方法，但采用恒溫或變溫的熱空氣處理帶病母株結合莖尖剝離，耗時長、成活率低、脫毒率不高且效率低。常用的草莓病毒檢測方法有指示植物小葉嫁接法、酶聯免疫吸附法(ELISA)和分子生物學方法等，其中指示植物小葉嫁接法耗時長，且需要一定的隔離空間；分子生物學方法所需儀器設備昂貴、檢測費用高，對技術人員的業務水平要求較高[6]。Thompson等[7]提取草莓總RNA的研磨溶液中含有劇毒物質，不被廣泛采用；而血清學檢測方法具有簡便快速、靈敏度高、批次量大，檢測試劑盒已實現商品化供應等優點。

本試驗采用新疆主要推廣的草莓品種之一紅顏，采集匍匐莖為外植體建立無菌繁殖體系，并對無菌系瓶苗采用低溫與高溫對比處理后結合莖尖剝離脫毒，用血清學檢測病毒，研究其脫毒及檢測的優化方法，以建立優化的脫毒技術和檢測方法，便于基層工作者在草莓大規模生產中確定草莓感染病毒種類和為害程度。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 植物材料

供試材料為新疆生產建設兵團第六師國家科技園區設施基地引進栽培的草莓品種紅顏，所用試材均帶毒。

1.1.2 病毒檢測種類及方法

利用雙抗體夾心酶聯免疫法(DAS-ELISA)檢測草莓皺縮病毒(SCV)、草莓斑駁病毒(SMoV)、草莓輕型黃邊病毒(SMYEV)和草莓鑲脈病毒(SVBV)4種病毒，檢測試劑盒購自北京綠源大德生物科技有限公司。

1.2 試驗內容與方法

1.2.1 無菌繁殖體系建立

從田間選取生長健壯、匍匐莖充實、無病蟲斑、具典型性狀的優良紅顏草莓植株為母株，剪取剛抽出的匍匐莖頂端約2～3 cm，用1%洗潔精水溶液浸泡5 min并用玻璃棒輕微攪動后，再用自來水沖洗30～40 min，無菌水沖洗1～2次，移入超凈工作臺，倒入75%乙醇分別浸泡30 s，無菌水沖洗2～3次，轉入0.1%升汞溶液輕微攪動4 min，最后用無菌水沖洗4～5次，迅速用濾紙吸干水分，切取長度為1.0～1.5 cm接種到MS培養基中。培養條件為溫度(22±2)℃，光照12～14 h，光照強度1 000 lx。

1.2.2 高溫處理與莖尖剝離相結合對草莓成活率及脫毒效果的影響

本試驗參照盆栽苗移入培養箱的方法進行適當改進：將無菌系瓶苗放入3個人工智能氣候箱中，溫度逐步升至35、38和40 ℃處理28 d，以23.5 ℃處理為對照，然后剝取瓶苗莖尖0.2～0.3、0.3～0.5、0.5～0.8 mm的生長點作為3個處理，接種至誘導培養基，每瓶接入1個莖尖，誘導30～40 d后統計苗成活率。繼代培養2次后采集樣品并編號進行病毒檢測。

1.2.3 低溫處理與莖尖剝離相結合對草莓成活率及脫毒效果的影響

將無菌瓶苗分別置于-1、0、2、4、8、10 ℃處理28 d，以23.5 ℃處理為對照，剝取瓶苗莖尖0.2～0.3、0.3～0.5、0.5～0.8 mm的生長點作為3個處理，接種至誘導培養基，每瓶接入1個莖尖，誘導30～40 d后統計苗成活率。繼代培養2次后采集樣品編號進行病毒檢測。

1.2.4 病毒檢測

每個樣品稱取0.5 g，在經液氮預冷的研缽中快速研磨成粉末，取50 mg轉入1.5 mL離心管中，于1 000g離心20 min，取上清液，凍存于-20 ℃。在冰浴條件下配制洗滌緩沖液，洗板5次，按照說明書依次加入標本、標準品、HRP標記的檢測抗體，溫育并徹底洗滌，用底物TMB顯色，用酶標儀在450 nm下測定吸光度。根據檢測結果進行判斷，陽性對照孔D值平均值≥1.00，陰性對照孔D值平均值≤0.15，說明試驗結果有效。臨界值=陰性對照孔平均值+0.15。檢測數據≤臨界值為脫除病毒。

1.2.5 統計分析

試驗數據用DPS8.0軟件進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 熱處理與莖尖剝離結合對成活率及脫毒效果的影響

隨著溫度的提高，草莓無菌瓶苗的成活率逐漸降低(圖1)，表現為葉片逐漸萎蔫褪綠，隨著溫度升高，成活率逐漸下降，在同一溫度條件下，莖尖長度與成活率呈正相關。40 ℃恒溫處理7 d后，瓶苗下部葉片全部反卷，萎蔫失綠，出現不同程度的枯死；40 ℃處理21 d后有全株枯死現象，成活率低于5%。

經過高溫處理后，當草莓莖尖長度為0.2～0.3 mm時，直觀上無顯色反應，ELISA檢測值中4種病毒的光密度值均小于臨界值，說明脫毒效果最好；SVBV經過35、38、40 ℃處理后，莖尖長度為0.5～0.8 mm的樣品顯色為淺黃色，SVBV光密度值均大于0.223 5，該病毒沒有脫除，其余3種病毒脫除。對照莖尖長度為0.2～0.3 mm時無顯色，4個病毒光密度值均小于臨界值，病毒脫除；而對照中莖尖長度為0.3～0.5 mm、0.5～0.8 mm時顯色為淺黃色到黃色，測得的SCV、SMYEV、SVBV 3個病毒的光密度值均大于臨界值，病毒未脫除。這與魏永祥等[5]報道的鑲脈病毒SVBV耐熱性較強，常規熱處理方法很難脫除的結論一致。本試驗中SCV、SMYEV、SVBV脫毒效果與莖尖剝離大小有關，對照只在0.3 mm以下病毒可脫除，而高溫處理與莖尖剝離結合的莖尖長度0.5 mm病毒可脫除，可見高溫處理與莖尖培養相結合比單純的高溫處理或莖尖培養脫毒率高得多(圖2)。

2. 2 低溫處理與莖尖剝離結合對成活率及脫毒效果的影響

從顯色反應可以看出，-1和0 ℃處理后，無色，病毒脫除率為100%。當溫度逐漸升高至2 ℃以上時，莖尖長度為0.2～0.3 mm的脫毒效果較高，但成活率僅為25.30%；莖尖長度大于0.5 mm以上的成活率較高，達65.32%～85.00%，但是病毒檢測顯色為淺黃色，光密度數值大于臨界值，沒能達到脫除病毒的要求。在實際操作過程中，剝取0.2～0.3 mm的莖尖難度較大，莖尖太小易失水而失活，且生長周期較長，不符合實際生產的要求，因此，選擇長度為0.3～0.5 mm的莖尖在-1 ℃進行脫毒為最佳方式，既可以保證較高的脫毒率，又能保證莖尖的高成活率和生長速度(圖3)。

圖1 高溫處理結合莖尖剝離對成活率的影響Fig.1 The influence of high temperature treatment combined with stem tip stripping on the survival rate

圖2 高溫處理結合莖尖剝離對病毒脫除率的影響Fig.2 The influence of high temperature treatment combined with stem tip stripping on the rate of virus-free

從圖4可以看出，SCV病毒在莖尖長度為0.2～0.3 mm 時光密度檢測值小于臨界值，病毒脫除；莖尖長度為0.3～0.5 mm時，2 ℃及以下脫除，其余溫度處理沒有脫除；而莖尖長度為0.5～0.8 mm時，只有0 ℃及以下脫除，其余溫度沒有脫除。SMoV病毒在莖尖長度為0.2～0.3 mm時所有檢測值小于臨界值，病毒脫除；莖尖長度為0.3～0.5 mm時，10 ℃以下脫除，其余溫度沒有脫除；而莖尖長度為0.5～0.8 mm時，只有0 ℃及以下脫除，其余溫度沒有脫除。SMYEV病毒在莖尖長度為0.2～0.3 mm時所有檢測值小于臨界值，病毒脫除；莖尖長度為0.3～0.5 mm時，4 ℃以下脫除，其余溫度沒有脫除；而莖尖長度為0.5～0.8 mm時，只有0 ℃及以下脫除，其余溫度沒有脫除。SVBV病毒在莖尖長度為0.2～0.3 mm所有檢測值小于臨界值，病毒脫除；莖尖長度為0.3～0.5 mm和0.5～0.8 mm時，0 ℃以下脫除，其余溫度沒有脫除。

圖3 低溫處理結合莖尖剝離對成活率的影響Fig.3 The influence of low temperature treatment combined with stem tip stripping on the survival rate

3 討論

近年來，采用RT-PCR對草莓病毒進行檢測的分子技術具有靈敏、快速、特異性強等優點，但儀器設備昂貴、檢測費用高、操作要求高，不適用于基層檢測工作。雙抗體一步夾心酶聯免疫吸附法(DAS-ELISA)是最為靈敏的血清學技術之一，具有批量較大、準確度高、靈敏度高、特異性強、操作簡單，運用性強，直觀，節省人力和物資等優點，通過目測或酶標儀可判定結果，能快速而準確地檢測出草莓中含有的病毒類型。

植物的根尖和莖尖等頂端分生組織不含病毒的部分是極小的，不超過0.1～0.5 mm[8]。熱處理草莓植株，所用時間長，植株易死亡，且脫毒率較低；而用田間匍匐莖直接消毒，莖尖剝離誘導，污染率可高達60%，導致成活率偏低。本試驗采集科技園區的匍匐莖，消毒處理培養成無菌瓶苗，再進行莖尖剝離脫毒和培養，使污染率有效降低至5%以下。同時，本試驗結果表明，采用直接莖尖培養法對草莓的脫毒效果并不理想；而采用逐步升溫法至38 ℃處理試管苗30 d，莖尖長度在0.8 mm以下的草莓試管苗100%脫除了草莓輕型黃邊病毒、斑駁病毒和皺縮病毒；40 ℃熱處理試管苗，莖尖長度在0.5～0.8 mm的成活率很低，僅為4.3%，但是4種病毒均可脫除。由此可見，不同病毒種類的耐熱性不同，對于種苗攜帶的不同病毒而采取的不同溫度梯度、時間長短設計、熱處理方式結合莖尖剝離等處理的合理搭配對存活率和脫毒率的影響還有待于進一步深入研究。

Helliot等[9]用超低溫成功地去除了黃瓜花葉病毒(CMV)和香蕉條斑病毒(BSV)。本試驗采用低溫處理，對照的莖尖大小為0.3 mm以下時脫毒效果較好，但成活率僅有22.67%。而采用低溫-1和0 ℃處理30 d，莖尖大小為0.5 mm時能脫除4種病毒，成活率提高40%～60%。由此，對于耐0 ℃低溫的植物，可以采用低溫處理與莖尖剝離相結合的方式進行脫毒，既能提高脫毒率又能提高莖尖成活率，且能保證莖尖生長的速度，整個操作過程簡單易行，滿足大規模實際生產的需要。除了溫度處理結合莖尖剝離脫毒，還可采用的二次莖尖脫毒方法，不僅可以提高草莓莖尖的脫毒效果，降低污染率，同時又能提高莖尖的分化率，加快繁育速度[10]。低溫處理結合莖尖剝離與二次莖尖脫毒，哪一種更優，還有待于后續的進一步研究。

致謝：感謝中國林業科學研究院王小藝博士和浙江農業科學院王衛平研究員對本文的精心指導!

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(責任編輯 張 韻)

Detoxification protocal optimization and virus detection in strawberry variety Hongyan

CHEN Ying， XIAO Chunlin， LUO Yanna， ZHANG Xiying， LIU Jiangna

(ResearchInstituteofAgriculturalSciences，the6thAgriculturalProductionDivisionofXinjiangProductionandConstructionCorps，Wujiaqu831300，China)

With strawberry variety Hongyan as the material， the sterile container seedlings were treated with high temperature treatment， low temperature freezing treatment combined with stem tip off detoxification. The double antibody step of serology and the clip art enzyme-linked immunoassay detection method were carried out to detect four kinds of virus. The survival rate and the detoxification efficiency of seedlings induced by meristem cells were compared. The results showed that the survival rate increased from 23.0% to 39.6%-60.0% under-1 ℃ cryogenic treatment with the stem tip stripping length increased from 0.3 mm to 0.5 mm， and all four virus were removed by the double antibody sandwich enzyme-linked immunoassay detection.

strawberry; temperature; virus-free meristem; virus detection; optimization

10.3969/j.issn.1004-1524.2017.06.15

2017-02-09

國家十二五科技支撐計劃項目(2012BAD41B00)

陳英(1967—)，女，湖北黃陂人，高級農藝師，主要從事特色作物脫毒快繁、育苗栽培技術的研究與應用。E-mail： 1131382130@qq.com

S668.4

A

1004-1524(2017)06-0966-05