豬Nramp1基因內(nèi)含子6多態(tài)性與仔豬腹瀉的相關(guān)性

古少波，杜 倩，舒 丹，李志瑕，田曉靜，劉麗霞

(西北民族大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州730030)

豬Nramp1基因內(nèi)含子6多態(tài)性與仔豬腹瀉的相關(guān)性

古少波，杜 倩，舒 丹，李志瑕，田曉靜，劉麗霞*

(西北民族大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州730030)

為了研究豬Nramp1基因內(nèi)含子6的多態(tài)性與仔豬腹瀉的相關(guān)性，采用PCR-RFLP法對八眉豬和煙臺黑豬Nramp1基因內(nèi)含子6的多態(tài)性進(jìn)行研究。結(jié)果表明：兩個豬種在該基因內(nèi)含子6的多態(tài)性較低，共檢測到兩個等位基因(A、B)和兩種基因型(AB、BB)，八眉豬多態(tài)信息含量(PIC)為0.33，煙臺黑豬為0.36?？ǚ竭m合性檢驗顯示，兩豬種的Nramp1 基因內(nèi)含子6極顯著偏離Hardy-Weinberg平衡(P<0.01)。相關(guān)性分析結(jié)果表明，八眉豬對腹瀉的抵抗能力顯著高于煙臺黑豬(P<0.05)。性別與Nramp1基因內(nèi)含子6基因型對仔豬腹瀉影響不顯著(P>0.05)，而性別與基因型的互作對仔豬腹瀉有顯著影響(P<0.05)，在母豬群體中，AB基因型的腹瀉評分極顯著大于BB基因型(P<0.01)；在公豬群體中，AB和BB基因型腹瀉評分差異不顯著(P>0.05)。

八眉豬；煙臺黑豬；Nramp1基因；腹瀉；多態(tài)性

長期以來，人們對畜禽類動物的選育多出于經(jīng)濟方面的考慮。隨著人類需求的不斷提高，養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴大，各種抗生素等藥物的濫用，導(dǎo)致病原微生物的抗藥性不斷增強，使得疫病防控問題變得更加嚴(yán)峻，在基因水平上對動物進(jìn)行抗病基因選育的重要性也日漸凸顯。仔豬腹瀉給養(yǎng)豬產(chǎn)業(yè)帶來了巨大的損失。疾病的發(fā)生主要取決于自然環(huán)境和群體免疫水平，當(dāng)前亟待解決的難題是篩選抗病基因型并培育出抗病能力強的品種。天然抗性相關(guān)巨噬蛋白1(natural resistance associated marophage protein 1，Nramp1)基因作為抗病育種的候選基因在抗病方面存在極大的應(yīng)用價值。Nramp1基因是一個比較保守的基因，影響動物的自身免疫，與沙門氏菌及多種胞內(nèi)寄生病原菌的抵抗作用有關(guān)，對疾病的抗性具有非病原特異性[1]。近年來，隨著分子生物學(xué)及分子遺傳學(xué)研究的日益深入，技術(shù)日益成熟，在基因水平研究豬Nramp1基因的多態(tài)性有助于通過分子遺傳的方法對其進(jìn)行抗病育種。

Belouchi等[2]最初在小鼠(musmusculus)身上發(fā)現(xiàn)Nramp基因，隨后將該類基因命名為Nramp基因家族，Nramp1基因作為該基因家族的成員能夠編碼具有完整膜的磷酸糖蛋白，含有10～12個推定的轉(zhuǎn)膜區(qū)域，具有離子通道和轉(zhuǎn)運功能特征，是一個較為保守的基因[3]，主要存在于血液外周白細(xì)胞以及脾臟、肺等具有網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞的器官，與多種病原微生物的抗性有關(guān)，其作用機理是通過轉(zhuǎn)運細(xì)菌自身合成防御酶系所必需的金屬離子如Mn2+或 Fe2+等，使病原微生物無法合成防御酶系，從而使動物免受細(xì)菌等病原體的侵染[4]。研究表明，人、鼠、豬的Nramp1基因均包括15個外顯子和14個內(nèi)含子，人Nramp1基因全長為13 604 bp，小鼠與豬的分別為12 kb和15 kb左右[5-7]。豬的Nramp1基因被定位于第15號染色體的q23-26[8]。Nramp1基因特異表達(dá)于外周血細(xì)胞和吞噬細(xì)胞中，可以作為豬等畜禽動物綜合抗病能力篩選的良好候選基因[9]。

目前國內(nèi)外學(xué)者關(guān)于Nramp1基因做了大量研究工作，Liu 等[10]通過對雞的SNP分析發(fā)現(xiàn)，保守區(qū)的 SNP 與腸炎沙門氏菌疫苗接種及病原攻擊后的免疫應(yīng)答相關(guān)。Paixao等[11]通過 SSCA 法分析荷斯坦牛和瘤牛Nramp1基因 3′UTR 區(qū)的遺傳變異，發(fā)現(xiàn)不同品種間基因頻率差異顯著，且不同基因型對布魯氏菌的抗性和敏感性差異顯著。羅文華[7]研究發(fā)現(xiàn)豬Nramp1基因的第6內(nèi)含子存在多態(tài)位點。吳宏梅等[9]在大白豬和松遼黑豬中證實了該多態(tài)位點，并發(fā)現(xiàn)該多態(tài)位點與豬中性粒細(xì)胞還原力和單核細(xì)胞的細(xì)胞毒作用百分率間呈顯著相關(guān)，認(rèn)為Nramp1基因可作為豬抗病力篩選的一個主要候選基因。楊軍等[12]對豬的Nramp1基因第6內(nèi)含子進(jìn)行多態(tài)性研究，發(fā)現(xiàn)群體中該位點雜合度較高、純合度較低，具有中度遺傳多態(tài)性。Fattahi-Dolatab等[13]通過對人Nramp1基因D543N多態(tài)性研究發(fā)現(xiàn)，患皮膚利什曼病患者與健康個體的基因型存在極顯著差異。Liu等[14]通過PCR-RFLP方法研究Nramp1基因多態(tài)性與荷斯坦牛肺結(jié)核病的相關(guān)性，建立了兩個遺傳標(biāo)記，認(rèn)為該基因是研究其多態(tài)性與結(jié)核病相關(guān)的良好的候選基因。Hedges等[15]通過研究Nramp1基因提高小鼠對貝納特氏立克次體(Coxiellaburnetii)的抵抗能力發(fā)現(xiàn)該基因產(chǎn)生的蛋白在先天免疫保護中具有重要作用。由此可見，探索Nramp1基因多態(tài)性與疾病之間的關(guān)聯(lián)性具有一定的理論價值和實際意義。

本研究利用PCR-RFLP法，對八眉豬和煙臺黑豬Nramp1基因內(nèi)含子6進(jìn)行多態(tài)性分析，研究該基因與仔豬腹瀉的相關(guān)性，以期尋找對抗仔豬腹瀉的遺傳標(biāo)記，并在分子遺傳和育種水平上為選育抗病能力強的品種提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本研究以青?；ブh102頭八眉豬和蘭州市紅古區(qū)41頭煙臺黑豬為實驗材料，將采集的豬耳組織置于裝有75%酒精的EP管中，運回實驗室保存于-20 ℃冰箱內(nèi)。采用苯酚/氯仿抽提法對兩豬種基因組DNA進(jìn)行提取，置-20 ℃凍存?zhèn)溆?。采?.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測基因組DNA 的濃度。

仔豬哺乳期間每天早、中、晚觀察排便情況，分別檢查仔豬肛門有無糞便污染及紅腫情況，記錄，并按照仔豬糞便形狀及腹瀉判斷標(biāo)準(zhǔn)(表1)進(jìn)行評分[16]。

表1 仔豬腹瀉評分標(biāo)準(zhǔn)

Table 1 Scoring criterion of piglet diarrhea

腹瀉程度Diarrheadegree糞便形態(tài)觀察Shapeobservationofthefaeces腹瀉指數(shù)Diarrheaindex正常Normal條狀Strip0輕微Slight成形且較軟Formingandsoft1中度Moderate糞水無分離現(xiàn)象,稀便Manurewaterwithoutseparation,loosestools2嚴(yán)重Serious液體,不成形,糞水分離Liquid,deformed,manurewaterseparation3

1.2 實驗方法

1.2.1 引物設(shè)計

根據(jù)文獻(xiàn)報道，采用Nramp1基因內(nèi)含子6部分片段擴增引物進(jìn)行擴增[9]，上游引物為5′-GCCAGCTTCCACAGTCTCCAG-3′ ；下游引物為5′-GGGGGTACAAAGGGGAAGAAG-3′，由寶生物工程(大連)有限公司合成。

1.2.2 PCR擴增

PCR擴增體系：DNA模板0.8 μL，上下游引物各0.4 μL，2×PowerTaqPCR MasterMix 11.0 μL，加ddH2O至20 μL。

PCR擴增條件：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，60 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，循環(huán)30次，72 ℃再延伸8 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物采用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.3 限制性內(nèi)切酶酶切體系及電泳檢測

酶切反應(yīng)體系：PCR擴增產(chǎn)物3.0 μL，限制性內(nèi)切酶NdeⅠ(識別位點序列為CA^TATG)0.2 μL，Cutsmart Buffer 1.0 μL，加ddH2O至10 μL，37 ℃恒溫水浴過夜。酶切產(chǎn)物采用 8% 非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行檢測，酶切產(chǎn)物與 2.5 μL 6×Loading Buffer混合，常溫下200 V 預(yù)電泳30 min，150 V 電泳4 h。電泳結(jié)束，用銀染顯色法判定基因型，染色過程的水浴溫度保持56 ℃。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析

利用PopGene軟件計算基因型頻率、等位基因頻率、純合度(Ho)、雜合度(He)、有效等位基因數(shù)(Ne)，并進(jìn)行基因型分布的Hardy-Weinberg平衡檢驗；利用PIC軟件計算多態(tài)信息含量；通過SPSS17.0軟件建立模型進(jìn)行腹瀉相關(guān)性分析，統(tǒng)計模型為：

Yijk=μ+Bi+Gj+Sk+eijk。

式中：Yijk為仔豬腹瀉評分分值；μ為群體均值；Bi為第i個品種的固定效應(yīng)；Gj為第j種基因型的固定效應(yīng)；Sk為第k種性別的固定效應(yīng)；eijk為隨機殘差效應(yīng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴增Nramp1基因內(nèi)含子6

采用1%的瓊脂糖凝膠檢測PCR產(chǎn)物，擴增產(chǎn)物電泳分析結(jié)果如圖1所示。Nramp1基因內(nèi)含子6的擴增片段大小在500 bp附近，與預(yù)期擴增片段大小相符，條帶清晰，無雜帶，特異性良好，能夠用于PCR-RFLP分析。

2.2Nramp1基因NdeⅠ酶切產(chǎn)物的電泳分析

利用8%聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測分析Nramp1基因內(nèi)含子6酶切產(chǎn)物(圖2)，共檢測到2個等位基因A、B和2種基因型AB、BB，其中AB基因型為3個片段(483 bp/373 bp/110 bp)，BB基因型為2個片段(373 bp/110 bp)。

2.3 PCR-RFLP基因型和等位基因頻率分布及其多態(tài)性分析結(jié)果

八眉豬和煙臺黑豬Nramp1基因內(nèi)含子6基因型和等位基因頻率見表2。由表2可知，兩豬種優(yōu)勢基因型均為AB型，B基因為優(yōu)勢等位基因。χ2檢驗結(jié)果表明，八眉豬和煙臺黑豬Nramp1基因在該位點上極顯著偏離Hardy-Wein-berg平衡。

1～7，PCR產(chǎn)物；M，DL 2 000 Ladder(Dye Plus)1-7， PCR production; M， DL 2 000 DNA Ladder (Dye Plus)圖1 Nramp1基因內(nèi)含子6 PCR產(chǎn)物檢測結(jié)果Fig.1 PCR product of Nramp1 intron 6

M， 20 bp DNA ladder；1、2、6、11， BB基因型；3～5和7～10， AB基因型M， 20 bp DNA Ladder; 1， 2， 6 and 11， Genotype BB; 3-5 and 7-10， Genotype AB圖2 Nramp1基因內(nèi)含子6 NdeⅠ酶切結(jié)果Fig.2 NdeⅠdigestion results of Nramp1 intron 6

多態(tài)信息含量(PIC)用來衡量動物體多態(tài)性的指標(biāo)，其與雜合度(He)、有效等位基因數(shù)(Ne)共同評價群體遺傳變異程度，遺傳參數(shù)的不同表明各群體之間的遺傳差異性[7]。由表3可知，八眉豬與煙臺黑豬雜合度均大于純合度，有效等位基因數(shù)均接近實際等位基因數(shù)，兩豬種多態(tài)信息含量(PIC)較低，分別為0.33和0.36。

2.4Nramp1基因與仔豬腹瀉的相關(guān)性分析結(jié)果

在兩豬種Nramp1基因內(nèi)含子6與仔豬腹瀉的相關(guān)性分析當(dāng)中，品種效應(yīng)對仔豬腹瀉有顯著影響(P<0.05)，無論是基因型效應(yīng)還是性別效應(yīng)對仔豬腹瀉的影響均不顯著(P>0. 05)，而性別與基因型的交互作用對仔豬腹瀉存在顯著影響(P<0.05)。

不同豬種的腹瀉評分見表4，品種差異與仔豬腹瀉存在顯著關(guān)聯(lián)性，其中煙臺黑豬的腹瀉評分明顯高于八眉豬(P<0.05)，說明煙臺黑豬對腹瀉更為敏感。不同性別個體Nramp1基因內(nèi)含子6的基因型與仔豬腹瀉間的相關(guān)性分析見表5。結(jié)果表明，在母豬群體中AB基因型腹瀉評分極顯著大于BB基因型(P<0.01)，說明母豬群體中AB基因型為易感基因型。在公豬群體中，AB和BB基因型對腹瀉影響不顯著(P>0.05)。

表2Nramp1基因內(nèi)含子6 基因型頻率和等位基因頻率

Table 2 Genotype and allele frequency ofNramp1 intron 6

品種Varieties基因型頻率GenotypefrequencyABBB等位基因頻率AllelicfrequencyABχ2值χ2value八眉豬Bameipig0.60(61)0.40(41)0.300.7018.21**煙臺黑豬Yantaiblackpig0.73(30)0.27(11)0.370.6313.12**

**表示差異極顯著P<0.01。括號中的數(shù)據(jù)為所檢測的個體數(shù)。

**means the very significant difference atP<0.01. The number in brackets is the number of detected individuals.

表3Nramp1 基因內(nèi)含子6遺傳多態(tài)性分析

Table 3 Genetic polymorphism analysis ofNramp1 intron 6

豬種Breed純合度(Ho)雜合度(He)有效等位基因數(shù)(Ne)多態(tài)信息含量(PIC)八眉豬Bameipig0.400.601.720.33煙臺黑豬Yantaiblackpig0.270.731.870.36

表4 品種對仔豬腹瀉評分的影響

Table 4 The correlation analysis of cultivated varieties in piglet diarrhea

同列數(shù)據(jù)后無相同小寫字母表示數(shù)據(jù)間差異顯著(P<0.05)。腹瀉評分分?jǐn)?shù)以最小二乘均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

The values without the same small letters in a column indicate the significant difference atP<0.05 level. Diarrhea score values are represented by least square means ± standard errors.

表5 不同性別豬Nramp1基因內(nèi)含子6的基因型對仔豬腹瀉評分的影響

Table 5 Correlation analysis of the genotypes ofNramp1 intron 6 in different gender and piglet diarrhea score

性別Gender基因型Genotype樣本數(shù)量Samplessize腹瀉評分Diarrheascore公豬AB910.76±0.167MaleBB520.83±0.262母豬AB911.15±0.193AFemaleBB520.24±0.280B

相同性別不同基因型之間比較，不同的大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。無字母表示差異不顯著(P>0.05)。腹瀉評分分?jǐn)?shù)以最小二乘均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

Between genotypes in the same gender， the values without the same capital letter indicate the significant difference atP<0.01 level，and the values without letter indicate no significant difference (P>0.05). Diarrhea score values are represented by least square means ± standard errors.

3 討論

3.1Nramp1基因內(nèi)含子6遺傳多態(tài)性分析

動物的抗病性通常是多種不同性狀的共同體現(xiàn)，它們受遺傳和環(huán)境因素的共同影響。Nramp1基因是天然抗性相關(guān)巨噬蛋白(Nramp)基因家族的成員，是畜禽類動物抗病育種的重要候選基因，它與牛、雞等動物的多種疾病存在相關(guān)性，研究仔豬腹瀉與該基因的相關(guān)性存在一定的意義和價值。趙生國等[17]通過對大白、長白等4個豬種的Nramp1基因內(nèi)含子6進(jìn)行研究，共檢測到3個基因型并發(fā)現(xiàn)在該基因第6內(nèi)含子NdeⅠ酶切位點處各豬種表現(xiàn)出中度多態(tài)性。劉艷冬等[18]通過對貴州地方豬種Nramp1基因內(nèi)含子6研究發(fā)現(xiàn)該基因NdeⅠ酶切位點多態(tài)性在各豬種中較豐富。本研究利用PCR-RFLP技術(shù)，在八眉豬和煙臺黑豬143個個體中僅檢測到Nramp1基因內(nèi)含子6的2個等位基因(A和B)和兩種基因型(AB和BB)，這說明Nramp1基因內(nèi)含子6的多態(tài)性較低。兩豬種均未檢測到AA基因型，這可能是由于AA基因型為劣勢基因型，在長期的進(jìn)化選擇當(dāng)中，該基因型個體逐漸被淘汰，這與前人研究大白豬、長白豬等豬種的檢測結(jié)果一致[7，9，12]。八眉豬和煙臺黑豬Nramp1基因內(nèi)含子6的AB基因型為優(yōu)勢基因型，B基因為優(yōu)勢基因，這與劉艷冬等[18]的研究結(jié)果一致。

卡方適合性檢驗結(jié)果顯示，兩豬種的Nramp1基因內(nèi)含子6極顯著偏離Hardy-Weinberg平衡(P<0.01)，這可能是由于在長期的人工選育過程中，所承受的壓力較大，從而對Nramp1基因產(chǎn)生一定的影響。He、Ne和PIC常用來衡量群體遺傳變異程度，本研究發(fā)現(xiàn)，八眉豬和煙臺黑豬Nramp1基因具有較高的He，說明這兩個豬種的遺傳多樣性較為豐富，這可能是由于雜合子個體的某些性能高于純合子個體，使得純合子個體在長期的自然選擇和人工選育過程中逐漸被淘汰，而雜合子個體被較多地保留了下來。而兩豬種Ne值均接近實際等位基因數(shù)，且PIC值在0.25至0.5之間，進(jìn)一步說明兩豬種Nramp1基因內(nèi)含子6多態(tài)性并不豐富。

3.2 品種、性別和基因型對仔豬腹瀉的影響

本研究表明，不同品種間仔豬腹瀉差異顯著(P<0.05)，八眉豬對腹瀉的抵抗能力比煙臺黑豬強，這可能是由于青海八眉豬在長期進(jìn)化和人工選育過程中逐漸適應(yīng)復(fù)雜的自然環(huán)境，對疾病有較強的抵抗能力。單獨的性別和Nramp1基因內(nèi)含子6基因型對仔豬腹瀉影響均不顯著(P>0.05)，但性別與基因型互作對仔豬腹瀉存在顯著的影響(P<0.05)，在母豬群體中AB基因型的腹瀉評分極顯著大于BB基因型(P<0.01)，說明母豬群體中AB基因型為易感基因型，而在公豬群體中，AB和BB基因型的腹瀉評分差異不顯著(P>0.05)，這可能是由于公豬和母豬自身免疫力水平差異所致，也可能是由于長期的自然和人工選擇對不同性別仔豬對腹瀉的抵抗能力產(chǎn)生了一定影響。

4 結(jié)論

本研究表明，八眉豬和煙臺黑豬的Nramp1基因內(nèi)含子6為中度多態(tài)，八眉豬對腹瀉的抵抗力較強，Nramp1基因內(nèi)含子6的AB基因型是八眉豬和煙臺黑豬的母豬群體對于腹瀉的易感基因型。本研究結(jié)果可作為對仔豬易感腹瀉個體進(jìn)行認(rèn)識的遺傳標(biāo)記，并在分子遺傳和育種水平上為選育抗病能力強的豬種提供理論參考。

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(責(zé)任編輯 盧福莊)

Polymorphism ofNramp1 intron 6 and its correlation with piglet diarrhea

GU Shaobo， DU Qian， SHU Dan， LI Zhixia， TIAN Xiaojing， LIU Lixia*

(CollegeofLifeScienceandEngineering，NorthwestMinzuUniversity,Lanzhou730030，China)

In order to research the polymorphism ofNramp1 intron 6 and its correlation with piglet diarrhea， this study analyzed the polymorphism of theNramp1 intron 6 in Bamei pig and Yantai black pig by PCR-RFLP. The results showed that the polymorphisms ofNramp1 intron 6 were not rich in two pig breeds， two alleles (A， B) and two genotypes (AB， BB) were detected， the polymorphic information content was 0.33 in Bamei pig and 0.36 in Yantai black pig. The Chi square fit test showed that theNramp1 intron 6 deviated from Hardy-Weinberg balance extremely in two pig breeds (P<0.01). The results of the least square showed that， the diarrhea resistance ability of Bamei pig was stronger than that of Yantai black pig (P<0.05). The gender and genotype of theNramp1 intron 6 did not significantly influence piglet diarrhea alone (P>0.05)， but the interaction of the gender and genotype influenced piglet diarrhea significantly (P<0.05) in female piglets， and the diarrhea score of genotype AB was greater than that of genotype BB (P<0.01)， while in male piglets， these two genotypes had not significant difference in diarrhea score (P>0.05).

Bamei pig; Yantai black pig;Nramp1 gene; diarrhea; polymorphism

10.3969/j.issn.1004-1524.2017.06.04

2016-12-19

西北民族大學(xué)中央學(xué)?；究蒲袠I(yè)務(wù)費專項資金資助項目(31920170029)；西北民族大學(xué)本科生科研創(chuàng)新項目(URIP16196)

古少波(1994—)，男，山西朔州人，本科生,研究方向為分子生物學(xué)。E-mail：gu.1994@foxmail.com

*通信作者，劉麗霞，E-mail: skllx@xbmu.edu.cn

S828

A

1004-1524(2017)06-0882-06