苯甲酰矢車菊素-3-葡萄糖苷的酶法合成及結構表征

閆 征，李春陽，黃午陽，張麗霞

(江蘇省農業科學院 農產品加工研究所，江蘇 南京 210014)

苯甲酰矢車菊素-3-葡萄糖苷的酶法合成及結構表征

閆 征，李春陽，黃午陽，張麗霞*

(江蘇省農業科學院 農產品加工研究所，江蘇 南京 210014)

采用響應面分析確定脂肪酶催化合成酰基化矢車菊素-3-葡萄糖苷的最佳工藝，并通過液質聯用和核磁共振對產物進行鑒定。結果顯示，以酰基化反應轉化率為指標的最佳工藝條件為：反應溫度41 ℃，真空度-90 kPa，酶濃度43 mg·mL-1，矢車菊素-3-葡萄糖苷濃度10 mg·mL-1，苯甲酸甲酯濃度0.4 g·mL-1，反應時間24 h，最終轉化率為90.92%。矢車菊素-3-葡萄糖苷的酰基化產物經液質聯用和核磁共振鑒定為矢車菊素-3-(6-苯甲酰)葡萄糖苷。

矢車菊素-3-葡萄糖苷；苯甲酰化；脂肪酶

矢車菊素-3-葡萄糖苷(cyanidin-3-glucoside，C3G)是黑米色素的主要成分[1-3]，是最常見、分布最廣的一種天然花色苷色素。天然花色苷色素具有安全、無毒、無異味、色彩鮮艷等特點，同時還具有多種營養保健和藥理作用[4-7]。在當今化學合成色素越來越受到消費者抵制的情況下，天然花色苷作為合成色素的替代品具有很大的發展空間。但是花色苷的不穩定性一直是制約其作為食用色素廣泛應用的主要因素[8-9]。研究發現，天然芳香族酰基花色苷比非酰基花色苷穩定性高[10-11]，如對非酰基花色苷進行人工酰基化，提高其穩定性，將極大地擴展天然花色苷色素的應用范圍。

Lv等[12]使用化學方法，利用辛烯基琥珀酸酰化了黑米花色苷；Stevenson等[13]酶法合成了酰基化藍莓花色苷；de Castro等[14]用Novozym 435脂肪酶催化，合成了酰基化擬愛神木花色苷；Enaud等[15]利用芳香酸甲酯，基于脂肪酶催化下的轉酯作用合成了芳香酰根皮苷酯。與化學法酰基化相比，生物酶法酰基化具有區域選擇性高、反應步驟少、反應條件溫和、簡單可控等優點，尤其是對于像花色苷這類易分解、穩定性差的天然化合物，酶催化法比化學法更加適用。Adamczak等[16]對脂肪酶固定化方法進行了研究，結果表明，固定化可提高酶的穩定性，促進產物分離和酶的重復利用，更加適用于有機溶劑中對花色苷等黃酮類物質的酰基化。筆者所在研究團隊在前期研究中利用脂肪酶催化合成了多種酰基化C3G，其中苯甲酰C3G合成效果最好，轉化率最高，且產物的熱穩定性、光穩定性比C3G有大幅度提高[17]。

目前，與同屬黃酮類物質的其他天然化合物的酶法酰基化相比，采用酶法酰基化花色苷的研究較少。本研究擬以固定化脂肪酶Novozym435為生物催化劑，通過減壓條件下苯甲酸甲酯和黑米C3G在吡啶溶劑中發生的酯交換反應工藝，分析產物結構，考查真空度、酶濃度、底物濃度、反應溫度等對轉化率的影響，基于響應面分析對合成工藝進行優化，并利用液質聯用色譜和核磁共振對產物結構進行表征，為酶法酰基化花色苷技術的開發提供參考與理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

矢車菊素-3-葡萄糖苷(由黑米提取純化獲得，含量≥80%)參照閆征等[18]的方法自行制備。脂肪酶Novozym435由諾維信(中國)生物技術有限公司提供。吡啶、苯甲酸甲酯等均為國產分析純，購自南京化學試劑有限公司。試驗儀器和設備包括：RE-5250型旋轉蒸發儀，上海亞榮生化儀器廠；Agilent 1100高效液相色譜儀，美國Agilent公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 C3G的酶法酰基化

將C3G、脂肪酶Novozym435及反應容器在30 ℃下真空干燥24 h以上，有機試劑吡啶、苯甲酸甲酯用4A分子篩干燥48 h備用。在250 mL燒瓶中加入一定量的黑米C3G，加入少量吡啶使C3G完全溶解，再加入一定量苯甲酸甲酯和脂肪酶Novozym435，最后加入吡啶使反應液總體積為5 mL。將反應體系在旋轉蒸發儀上以一定的溫度和真空度，轉速20 r·min-1反應24 h。

1.2.2 HPLC條件

色譜柱，Zorbax SB-C18反相色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相A為6%乙酸水溶液，B為6%乙酸乙腈溶液。梯度設計：0—25 min，5%～30%流動相B；25—35 min，30%～80%流動相B；35—45 min，80%～5%流動相B；45—50 min，5%流動相B。進樣量10 μL，檢測波長分別為520、280 nm，流速0.6 mL·min-1。

1.2.3 轉化率和收率測定

采用高效液相色譜法測定，色譜條件見1.2.2節。按下列公式計算轉化率和收率：

(1)

(2)

式(1)、(2)中：A1為未反應的C3G峰面積；A2為酰基化C3G的峰面積；n為實際得到的苯甲酰化矢車菊素-3-葡萄糖苷的物質的量，mmol；N為理論上應得的苯甲酰化矢車菊素-3-葡萄糖苷的物質的量(以矢車菊素-3-葡萄糖苷加入量計)，mmol。

1.2.4 反應產物的結構表征

質譜分析：質量掃描范圍，m/z 200～2 000；離子方式，毛細管電壓正離子模式，3.0kV；毛細管溫度350 ℃；干燥氣與霧化氣均為N2。

核磁共振分析：將分離純化后的酰基化C3G產物溶解于氘代甲醇中，采用500MHz掃描，測定各化合物的氫譜(1H-NMR)和碳譜(13C-NMR)。

1.3 試驗設計

1.3.1 單因素試驗

通過前期試驗，確定反應在苯甲酸甲酯過量情況下效果較好，因此選擇苯甲酸甲酯添加濃度0.4g·mL-1；反應在24h后可達到平衡，因此取反應時間為24h。按1.2.1節方法，真空度-90kPa，反應溫度40 ℃，C3G濃度10g·mL-1，脂肪酶Novozym435 40mg·mL-1。固定其他反應條件，分別考查真空度(-60、-70、-80、-90、-100kPa)、反應溫度(20、30、40、50 ℃)、脂肪酶用量(10、20、30、40、50、60mg·mL-1)、C3G濃度(4、6、8、10、12、14mg·mL-1)對轉化率的影響。

1.3.2 響應面試驗設計

在單因素試驗基礎上，確定對轉化率影響較大的4個因素分別為真空度(X1，kPa)、反應溫度(X2，℃)、脂肪酶用量(X3，mg·mL-1)以及C3G濃度(X4，mg·mL-1)，對其進行4因素3水平的Box-Behnken試驗設計，如表1所示。采用軟件Desigeexpert進行方差分析及反應參數優化。

2 結果與分析

表1 因子水平表

Table1Independentvariablesandtheirlevels

編碼Code水平Level-10+1X1-95-90-85X2304050X3304050X481012

2.1 單因素試驗

2.1.1 真空度對轉化率的影響

減壓條件可使酯交換產生的反應副產物甲醇在設定的反應溫度下蒸發，脫離反應體系，從而使反應向生成酰基化C3G的方向進行。如果真空度過低，會使溶劑和底物也發生蒸發，從而影響反應的進度；因此，必須選擇適當的真空度以維持反應體系的穩定。考查真空度-60～-100 kPa下脂肪酶催化反應中轉化率的變化，結果如圖1所示。當真空度為-60 kPa時，反應轉化率極低，幾乎無產物生成。隨著真空度增加，轉化率不斷提高。當真空度達到-90 kPa時，反應24 h后轉化率最高。可見，在一定的范圍內提高真空度可以大幅度提高轉化率和反應速度，但是更高的真空度會造成溶劑的過快蒸發，使反應無法進行，而且更高的真空度從技術和成本角度考慮也不適于實際生產；因此，本試驗采用-90 kPa作為反應條件。

2.1.2 反應溫度對轉化率的影響

溫度是酶促反應的重要影響因素之一。對于一般的酶促反應，溫度影響酶的穩定性及酶活，同時也影響底物及產物溶解度。隨著溫度升高，酶催化反應速度提高，但當溫度高過一定值時，酶的穩定性會下降，甚至造成失活。由于本試驗系在減壓條件下進行，過高的溫度還會造成溶劑的蒸發，因此，必須選擇適當的溫度以維持反應體系的穩定及酶的催化活性。如圖1所示，隨著溫度的升高，反應的轉化率增加，當溫度為40 ℃時達到最高轉化率，當溫度為50 ℃時，由于溶劑蒸發，反應中途終止，造成轉化率下降。這說明：低溫時反應物之間的傳質不佳，且酶活性較低，另外副產物甲醇的蒸發速度慢；當溫度升高，反應轉化率提升；當溫度超過50 ℃時，溶劑體系中的吡啶等有機溶劑蒸發損失，使反應未完成時就由于溶劑缺乏而終止，造成轉化率下降。

圖1 單因素試驗結果Fig.1 Results of single factor experiment

2.1.3 脂肪酶用量對轉化率的影響

酶用量是催化反應中的關鍵因素，酶用量主要影響酶促反應的速度。一般情況下，產物的轉化率會隨著酶用量的增加而提高。如圖1所示，當酶用量開始逐漸增加時，轉化率呈增長趨勢，但當酶用量超過40 mg·mL-1，轉化率幾乎不再提高。這可能是由于在此條件下，酶的量相對于底物的濃度已經飽和，轉化率無法進一步提高。

2.1.4 C3G濃度對轉化率的影響

如圖1所示，隨著C3G濃度的增加，轉化率有所提高，但當C3G的添加量超過10 mg·mL-1時，轉化率反而有所下降。C3G濃度的適當提高，可以提高酶與底物的結合機會，從而提高轉化率，但濃度過大會導致發生不溶于溶劑的現象，也會相對降低苯甲酸甲酯的有效濃度，從而在一定程度上阻礙反應的進行。

2.2 響應面法優化酶法苯甲酰化C3G工藝

2.2.1 多元回歸分析

對所構建的二次回歸方程進行方差分析(表3)，模型F值為49.50，P<0.000 1，失擬項F值為2.71，P>0.05，說明所構建的模型可靠。模型的擬合度R2為0.980 2，校正擬合度R2為0.960 4，信噪比26.332，說明所構建的二次模型模擬合理，可信度較高。對各因素回歸進行顯著性檢驗：一次項中真空度(X1)、反應溫度(X2)、脂肪酶用量(X3)對轉化率均有極顯著的影響(P<0.01)；交互項中X1X2交互作用對轉化率有極顯著的影響(P<0.01)。各因素對轉化率的影響大小依次為真空度(X1)>脂肪酶用量(X3)>反應溫度(X2)>C3G濃度(X4)。

2.2.2 響應面曲面分析

與多元回歸分析的結果一致，沿C3G濃度(X4)軸向的響應曲面較平滑，等高線變化較稀疏(圖2)，表明其對轉化率的影響較小，而真空度和反應溫度對轉化率的影響顯著，其他交互項對轉化率的影響不顯著。固定C3G濃度和脂肪酶用量的情況下，真空度對轉化率的影響比反應溫度大。對于轉化率的影響，真空度>脂肪酶用量，真空度>C3G濃度，脂肪酶用量>反應溫度，反應溫度>C3G濃度，脂肪酶用量>C3G濃度。

表2 試驗設計及檢測值

Table 2 Complete experimental conditions tested and corresponding observed values

試驗號No.編碼水平CodelevelX1X2X3X4轉化率Conversion/%1-1-10064.2021-10076.903-110075.404110070.50500-1-183.306001-181.20700-1177.408001185.909-100-171.5010100-175.1011-100172.4012100178.30130-1-1081.901401-1081.40150-11081.4016011086.3017-10-1072.301810-1076.4019-101075.5020101079.40210-10-173.5022010-180.30230-10180.6024010180.4025000091.8026000090.3027000091.0028000089.3029000090.70

表3 方差分析

Table 3 ANOVA analysis

來源Source總平方和Sumofsquares自由度Degreeoffreedom均方MeansquareFP模型Model1304.361493.1749.50<0.0001**X153.34153.3428.34<0.0001**X220.80120.8011.050.0050**X324.08124.0812.790.0030**X48.5018.504.520.0519X1X277.44177.4441.14<0.0001**X1X30.0110.010.0050.9429X1X41.3211.320.700.4160X2X37.2917.293.870.0692X2X412.25112.256.510.0231*X3X428.09128.0914.920.0017**X21916.241916.24486.77<0.0001**X22255.211255.21135.58<0.0001**X2342.93142.9322.810.0003**X24188.101188.1099.93<0.0001**殘差Residualerror26.35141.88失擬項Lackoffit22.96102.302.710.1744絕對偏差Pureerror3.3940.85總和Sum1330.7128

*與**分別表示差異顯著(P<0.05)與極顯著(P<0.01)。

* and**indicated significant difference atP<0.05 orP<0.01， respectively.

2.2.3 最優參數的確定及模型驗證

根據等值線圖確定最優條件：真空度-90 kPa，反應溫度41 ℃，脂肪酶用量43 mg·mL-1，C3G濃度10 mg·mL-1。在最優條件下，模型預測的轉化率為91.10%。對預測模型重復驗證3次，結果表明，反應的平均轉化率為90.92%，與預測模型一致。通過對反應前后底物及產物含量的測定可知，在最佳反應條件下苯甲酰C3G收率為85.42%。

2.3 酰基化反應產物的確證

采用HPLC-MS分析反應前后反應體系的花色苷組成及主要成分分子量，檢測波長為520 nm。圖3為反應前后體系的HPLC譜圖及主要物質的MS譜圖：反應前其主要花色苷成分峰保留時間為14.85 min，相對分子量為449.2，由前人的研究可知該物質為矢車菊素-3-葡萄糖苷[19-21]；反應后矢車菊素-3-葡萄糖苷的峰大幅度降低，新生成了保留時間為28.72 min的花色苷物質，相對分子量553.4，恰好為一個苯甲酸酰與一個矢車菊素-3-葡萄糖苷分子量之和，可見該反應為定向反應，主要產物為單酰基化產物(圖4)。二級質譜顯示產生了一個相對分子量287.1的離子碎片，可見苯甲酰應連接于葡萄糖苷上。核磁共振(NMR)分析的結果(圖5)也支持上述結論。

3 討論

C3G等花色苷類物質穩定性差，化學法酰基化易造成其降解褪色。以脂肪酶為代表的有機相中酶法酰基化可實現花色苷等黃酮糖苷類物質的酰基化。Stevenson等[13]用此法對藍莓提取物進行酰基化研究，結果發現，有酰基化花色苷生成，但反應時間較長，轉化率較低，且未對產物進行純化和鑒定。de Castro等[14]以棕櫚酸為酰基供體，Novozym435脂肪酶為催化劑，進行了擬愛神木花色苷的酰基化研究，結果成功合成了單棕櫚酸酰飛燕草素-3-葡萄糖苷和矢車菊素-3-葡萄糖苷。與前人對酶法酰基化花色苷的研究結果相比，本研究通過減壓條件下有機相中脂肪酶催化酯交換反應實現C3G的酰基化，酰基化率較高，而且反應時間較短，這主要是由于在設定反應條件下反應副產物甲醇能夠立即蒸發脫離反應體系，使反應能夠向生成產物的方向進行。使用苯甲酸甲酯為酰基供體成本較低，且未反應底物和溶劑回收利用容易。在實際生產中如采用該反應條件有助于獲得較高的C3G酰基化轉化率，縮短生產周期，提高生產效益。

X1， 真空度； X2， 反應溫度； X3， 脂肪酶用量； X4， C3G濃度X1， Vacuum; X2， Temperature; X3， Amount of enzyme; X4， Concentration of C3G圖2 響應面圖和等值線圖Fig.2 Response surface and contours

圖3 酰基化反應前后的HPLC-MS譜圖Fig.3 HPCL-MS spectra before and after reactionpurification

圖4 酰基化反應示意圖Fig.4 Diagrammatic sketch of acylation reaction

圖5 酰基化反應前后的NMR譜圖Fig.5 NMR spectra before and after reactionpurification

本研究通過單因素和響應面分析確定了脂肪酶催化的苯甲酸甲酯為酰基供體的C3G酰基化最佳反應條件：真空度-90 kPa，反應溫度41 ℃，酶用量43 mg·mL-1，C3G濃度10 mg·mL-1，苯甲酸甲酯濃度0.4 g·mL-1，反應時間24 h。在此條件下，平均轉化率為90.92%。酰基化產物經過質譜與核磁共振鑒定，推測產物為矢車菊素-3-(6-苯甲酰)葡萄糖苷，脂肪酶催化C3G酰基化的作用位點是葡萄糖苷的C-6位羥基。說明以脂肪酶為催化劑，苯甲酸甲酯為酰基供體，可以實現酰基化矢車菊素-3-葡萄糖苷的定向合成，且轉化率較高。

目前，對酶法酰基化花色苷的研究尚處于初級階段，今后將對反應體系進行擴大，爭取實現工業化生產。另外，要加強對不同酰基供體反應條件的優化，為天然花色苷的酶法修飾研究提供技術支持。

[1] EL-SM A A， YOUNG J C， RABALSKI I. Anthocyanin composition in black， blue， pink， purple， and red cereal grains[J].JournalofAgricultural&FoodChemistry， 2006， 54(13):4696-4704.

[2] GALVANO F， LA F L， VITAGLIONE P， et al. Bioavailability， antioxidant and biological properties of the natural free-radical scavengers cyanidin and related glycosides[J].AnnaliDellistitutoSuperioreDiSanita， 2007， 43(4): 382-393.

[3] SHAO Y， XU F， SUN X， et al. Identification and quantification of phenolic acids and anthocyanins as antioxidants in bran， embryo and endosperm of white， red and black rice kernels (OryzasativaL.)[J].JournalofCerealScience， 2014， 59(2): 211-218.

[4] BUENO J M， RAMOS-ESCUDERO F， SEZ-PLAZA P， et al. Analysis and antioxidant capacity of anthocyanin pigments. Part I: General considerations concerning polyphenols and flavonoids[J].CriticalReviewsinAnalyticalChemistry， 2012， 42(2):102-125.

[5] BUENO J M， SEZ-PLAZA P， RAMOS-ESCUDERO F， et al. Analysis and antioxidant capacity of anthocyanin pigments. Part II: Chemical structure， color， and intake of anthocyanins[J].CriticalReviewsinAnalyticalChemistry， 2012， 42(2): 126-151.

[6] POJER E， MATTIVI F， JOHNSON D， et al. The case for anthocyanin consumption to promote human health: A review[J].ComprehensiveReviewsinFoodScience&FoodSafety， 2013， 12(5): 483-508.

[7] FERNANDES I， FARIA A， CALHAU C， et al. Bioavailability of anthocyanins and derivatives[J].JournalofFunctionalFoods， 2014， 7(1):54-66.

[8] PATRAS A， BRUNTON N P， O’DONNELL C， et al. Effect of thermal processing on anthocyanin stability in foods; mechanisms and kinetics of degradation[J].TrendsinFoodScience&Technology， 2010， 21(1): 3-11.

[9] CAVALCANTI R N， SANTOS D T， MAA M. Non-thermal stabilization mechanisms of anthocyanins in model and food systems——An overview[J].FoodResearchInternational， 2011， 44(2):499-509.

[10] GIUSTI M M， RODRGUEZSAONA L E， WROLSTAD R E. Molar absorptivity and color characteristics of acylated and non-acylated pelargonidin-based anthocyanins[J].JournalofAgricultural&FoodChemistry， 1999， 47(11):4631-4637.

[11] STINTZING F C， STINTZING A S， CARLE R， et al. Color and antioxidant properties of cyanidin-based anthocyanin pigments[J].JournalofAgricultural&FoodChemistry， 2002， 50(21): 6172-6181.

[12] LV X L， SUN H L， JI Z Y. Acylation of anthocyanins from black rice and their stability properties[J].AdvancedMaterialsResearch， 2011， 204-210: 750-754.

[13] STEVENSON D E， WIBISONO R， JENSEN D J， et al. Direct acylation of flavonoid glycosides with phenolic acids catalysed byCandidaantarctica， lipase B (Novozym 435?)[J].Enzyme&MicrobialTechnology， 2006， 39(6):1236-1241.

[14] DE CASTRO V C， DA SILVA P H A， DE OLIVEIRA E B， et al. Extraction， identification and enzymatic synthesis of acylated derivatives of anthocyanins from jaboticaba (Myrciariacauliflora) fruits[J].InternationalJournalofFoodScience&Technology， 2014， 49(1): 196-204.

[15] ENAUD E， HUMEAU C， PIFFAUT B， et al. Enzymatic synthesis of new aromatic esters of phloridzin[J].JournalofMolecularCatalysisBEnzymatic， 2004， 27(1): 1-6.

[16] ADAMCZAK M， KRISHNA S H. Strategies for improving enzymes for efficient biocatalysis[J].FoodTechnology&Biotechnology， 2004， 128(4): 251-264.

[17] ZHENG Y， LI C， ZHANG L， et al. Enzymatic acylation of anthocyanin isolated from black rice with methyl aromatic acid ester as donor: Stability of the acylated derivatives[J].JournalofAgricultural&FoodChemistry， 2016， 64(5): 1137-1143.

[18] 閆征， 王四維， 李春陽. 聚酰胺樹脂分離純化黑米中矢車菊素-3-葡萄糖苷工藝研究[J]. 糧食與飼料工業， 2016， 12(4): 31-36. YAN Z， WANG S W， LI C Y. Purification of cyanidin-3-glucoside from black rice by polyamide resin[J].Cereal&FeedIndustry， 2016， 12(4): 31-36. (in Chinese with English abstract)

[19] CHEN L， XIN X， LAN R， et al. Isolation of cyanidin 3-glucoside from blue honeysuckle fruits by high-speed counter-current chromatography[J].FoodChemistry， 2014， 152(2): 386-390.

[20] 劉琴， 李敏， 胡秋輝. 黑米麩皮與紫包菜花青素提取物的組成、抗氧化性與穩定性比較研究[J]. 食品科學， 2012， 33(19):113-118. LIU Q， LI M， HU Q H. Comparative studies on the composition， antioxidant activity and stability of anthocyanins from black rice bran and purple cabbage[J].FoodScience， 2012， 33(19): 113-118. (in Chinese with English abstract)

[21] CHEN X Q， NAGAO N， ITANI T， et al. Anti-oxidative analysis， and identification and quantification of anthocyanin pigments in different coloured rice[J].FoodChemistry， 2012， 135(4): 2783-2788.

(責任編輯 高 峻)

Synthesis technology and benzoylation cyanidin-3-glucoside catalyzed by lipase and structural characterization

YAN Zheng， LI Chunyang， HUANG Wuyang， ZHANG Lixia*

(InstituteofFarmProductProcessing，JiangsuAcademyofAgriculturalSciences，Nanjing210014，China)

The synthetic process of acylated cyanidin-3-glucoside catalyzed by enzyme was optimized through single factor experiment and response surface analysis according to the degree of conversion， and the product was identified by HPLC-MS and NMR. The optimum conditions were as follows: 41 ℃，-90 kPa， 43 mg·mL-1enzyme applied， concentration of cyanidin-3-glucoside 10 mg·mL-1， concentration of methyl benzoate 0.4 g·mL-1， reaction time 24 h. The structures of acylated cyanidin-3-glucoside products were identified as 3-(6″-benzoyl)-glucoside.

cyanidin-3-glucoside; benzoylation; lipase

10.3969/j.issn.1004-1524.2017.06.21

2016-12-26

國家自然科學基金(31401489)

閆征(1978—)，男，黑龍江齊齊哈爾人，博士，助理研究員，研究方向為食品生物技術。E-mail: yz3737@sina.com

*通信作者，張麗霞，E-mail: zlx5885@163.com

TQ464.3

A

1004-1524(2017)06-1001-08