牛肉及其制品中摻入雞肉、鴨肉和豬肉的多重?cái)?shù)字PCR快速檢測(cè)方法研究

楊 華，汪小福，肖英平，魏 巍，徐俊鋒

(浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究所， 浙江 杭州 310021)

牛肉及其制品中摻入雞肉、鴨肉和豬肉的多重?cái)?shù)字PCR快速檢測(cè)方法研究

楊 華，汪小福，肖英平，魏 巍，徐俊鋒

(浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究所， 浙江 杭州 310021)

利用微滴式數(shù)字PCR，建立針對(duì)牛、豬、雞和鴨肉的多重?cái)?shù)字PCR檢測(cè)技術(shù)。結(jié)果表明，所選擇的4個(gè)物種的引物和探針特異性良好，能夠快速對(duì)樣品中是否存在這4種肉類成分做出快速判斷。數(shù)字PCR分析中，F(xiàn)AM和HEX兩個(gè)通道的熒光信號(hào)能很好地區(qū)分，在對(duì)9個(gè)實(shí)際樣品的檢測(cè)中，所在樣品的微滴生成數(shù)都在10 000以上，滿足數(shù)字PCR中泊松公式分析的要求，同時(shí)9個(gè)樣品的檢測(cè)結(jié)果與已知信息完全相符。

數(shù)字PCR；肉源性成分檢測(cè)；多重檢測(cè)；快速檢測(cè)

牛肉及其制品因其營養(yǎng)價(jià)值高、肉質(zhì)鮮嫩爽口等特點(diǎn)受到消費(fèi)者普遍歡迎，我國是人口大國，對(duì)牛肉及其制品的需求量逐年升高。牛肉的價(jià)格比雞鴨肉和豬肉的偏高。在利益驅(qū)動(dòng)下，有些企業(yè)和不法商販以低價(jià)肉代替高價(jià)肉，使用其他禽畜肉為原料，通過浸泡、添加香精等加工方式處理后，冒充牛肉進(jìn)行售賣[1]，從而牟取暴利，使得牛肉制品摻假問題嚴(yán)重，國內(nèi)“掛羊頭賣狗肉”現(xiàn)象更是屢次被媒體曝光。同時(shí)，豬肉、鴨肉等其肌纖維紋路與牛肉較為接近[2]，制成肉干、冷凍肉片等加工品后更是難以分辨，常能以假亂真，因其價(jià)格低廉，常用作牛肉摻假的原料。傳統(tǒng)的感官分辨肉質(zhì)品種的方法不能滿足檢測(cè)要求，因此迫切需要建立牛肉及其制品中摻入其他肉源性成分的檢測(cè)技術(shù)。

數(shù)字PCR(Digital PCR)的概念于1992年提出[3]，其基本原理是通過將微量樣品進(jìn)行大倍的稀釋和分液，直至每個(gè)擴(kuò)增區(qū)域含有目標(biāo)擴(kuò)增分子為0、1或1個(gè)以上，再進(jìn)行PCR擴(kuò)增，根據(jù)擴(kuò)增信號(hào)的有無，利用泊松分布(Poisson distribution)[4]計(jì)算出樣本的最初拷貝數(shù)或濃度。數(shù)字PCR不依賴擴(kuò)增效率及標(biāo)準(zhǔn)曲線的定量，且對(duì)一些PCR抑制因子的耐受性更高。該技術(shù)在基因拷貝數(shù)分析、基因表達(dá)分析、基因分型等方面都取得了突破性進(jìn)展[5-6]。在動(dòng)物源性成分檢測(cè)方面也有相應(yīng)研究報(bào)道，表明數(shù)字PCR在動(dòng)物源性成分檢測(cè)方面的可行性[7]。然而，目前的研究多數(shù)是針對(duì)單一動(dòng)物源性成分的檢測(cè)，無法滿足對(duì)肉制品中多種動(dòng)物源性成分檢測(cè)的需要。

本研究針對(duì)牛肉及其制品中可能摻入雞肉、鴨肉和豬肉的情況，建立數(shù)字PCR針對(duì)牛肉、雞肉、鴨肉和豬肉的4重?cái)?shù)字PCR檢測(cè)方法，將檢測(cè)牛肉的探針在5端標(biāo)記為FAM，3端標(biāo)記為BHQ1，而檢測(cè)雞肉、鴨肉和豬肉的探針在5端均標(biāo)記為HEX，3端標(biāo)記為BHQ1。檢測(cè)樣品中若含有牛肉成分，則FAM通道能檢測(cè)到相應(yīng)的熒光；反之，樣品中若無牛肉成分，則FAM通道無法檢測(cè)到熒光。若樣品中含有雞肉、鴨肉或豬肉中任何1種成分，則HEX通道有熒光檢出；若樣品中不含雞肉、鴨肉和豬肉成分，則沒有熒光檢出。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗(yàn)中的純?nèi)鈽悠?牛、羊、魚、豬、狗、雞、鴨、馬)購于市場(chǎng)，檢測(cè)樣本1～9號(hào)為本實(shí)驗(yàn)室收集的實(shí)際樣本，其動(dòng)物源性成分已知。其中1～3號(hào)樣品只含有牛肉成分，4，5號(hào)樣品含有牛肉和豬肉成分，6，8號(hào)含有牛肉和鴨肉，7號(hào)樣品含有牛肉、豬肉、雞肉和鴨肉成分，9號(hào)樣品含有牛肉和雞肉成分。

基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司)；ddPCR Master Mix，Droplet Generation Oil，Droplet Reader Oil(Bio-Rad，美國)。

1.2 試驗(yàn)儀器

Nanodrop ND-2000核酸蛋白定量儀(Thermo Scientific，美國)。DY-501型核酸電泳儀(上海精密科學(xué)儀器有限公司，上海)。QX100TMDroplet，Digital TM PCR系統(tǒng)(Bio-Rad，美國，包括微滴生成儀和微滴讀取儀)。ABI 7500定量PCR儀(Applied Biosystem，美國)。

1.3 方法

1.3.1 DNA提取

所有樣品基因組DNA提取使用天根公司的動(dòng)物組織DNA提取試劑盒，具體步驟見試劑盒說明書。所得基因組DNA質(zhì)量通過瓊脂糖凝膠電泳和Nanodrop ND-2000核酸蛋白定量儀評(píng)價(jià)。

1.3.2 引物和探針

試驗(yàn)中應(yīng)用的引物和探針來自相應(yīng)的文獻(xiàn)報(bào)道[8-11]，引物和探針由上海英俊生物科技有限公司合成，其核苷酸序列等信息見表1。

1.3.3 定量PCR體系及反應(yīng)條件

定量PCR反應(yīng)體積為25 μL，12.5 μL 2×TaqMan通用Mix，DNA模板(5 μL)，引物各300 nmol·L-1，100 nmol·L-1探針和5.2 μL的水。定量PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件為95 ℃ 10 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 60 s，共45個(gè)循環(huán)。每個(gè)試樣做3個(gè)平行反應(yīng)，重復(fù)3次。

1.3.4 數(shù)字PCR反應(yīng)體系和條件

表1 引物與探針信息

Table 1 Information of primers and probes

檢測(cè)目標(biāo)Detectiontargets引物名稱Name序列(5'→3')Sequences參考文獻(xiàn)Reference牛Beef-FCCGATGGATGTGTTCAGAGCT[8]BeefBeef-RGCCAAATGTCTGGGTGTAGAT-ACCBeef-PaTGGGCTTTAGGGCTTCCGAATGT-GAA雞Chicken-FCCAACATGCCTTTAAACCCTCA[9]ChickenChicken-RGGAACTGTAGCCTTCTGACTCGChicken-PbTGCCTTTCCTTCCCCGC-CAGTCTC鴨Duck-FGGCCTCCTACTGGCTATGCA[10]DuckDuck-RGAGTCAGCCATATTGGACGTTTDuck-PbCACCGCAGACACATCCCTT-GCTTTCT豬Pork-FCGAGAGGCTGCCGTAAAGG[11]PorkPork-RTGCAAGGAACACGGCTAAGTGPork-PbTCTGACGTGACTCCCCGACCT-GG

a，探針5′端和3′端分別標(biāo)記報(bào)告基團(tuán)FAM和淬滅基團(tuán)BHQ1；b，探針5′端和3′端分別標(biāo)記報(bào)告基團(tuán)HEX和淬滅基團(tuán)BHQ1。

a, Probe were labeled with 5′-FAM and 3′-BHQI; b, Probes were labeled with 5′-HEX and 3′-BHQI

微滴數(shù)字PCR反應(yīng)包括配制體系、生成微滴、擴(kuò)增循環(huán)和信號(hào)讀取4個(gè)步驟。優(yōu)化后的多重?cái)?shù)字PCR的擴(kuò)增體系見表2。微滴生成需要使用專門的微滴生成卡和微滴生成儀，將20 μL PCR體系和70 μL微滴生成油(droplet generation oil)加入微滴生成卡，覆蓋專用膠墊后置入微滴生成儀，生成微滴。

微滴數(shù)字PCR擴(kuò)增使用兩步法。94 ℃預(yù)變性10 min；94 ℃變性15 s，60 ℃退火60 s，共40個(gè)循環(huán)，擴(kuò)增結(jié)束后進(jìn)行98 ℃、10 min熱失活，每個(gè)模板重復(fù)3個(gè)平行檢測(cè)。擴(kuò)增結(jié)束后，將96孔板置入微滴讀取儀中讀取信號(hào)，并使用軟件Quanta Soft V1.6.6分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)，獲得絕對(duì)定量結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物與探針的特異性分析

利用熒光定量PCR的方法，分別用牛、豬、雞和鴨的各自的特異性引物與探針擴(kuò)增不同純?nèi)馄?牛、羊、魚、豬、狗、雞、鴨、馬)中的DNA成分，擴(kuò)增結(jié)果如圖1所示。

表2 多重?cái)?shù)字PCR擴(kuò)增體系

Table 2 The amplification system for multiple digit PCR

試劑Reagents終濃度/(nmol·L-1)Finalconcentration體積/μLVolumeddPCRMasterMix2×10Beef-F2500.5Beef-R2500.5Beef-P1500.3Chicken-F3000.6Chicken-R3000.6Chicken-P1500.3Duck-F2500.5Duck-R2500.5Duck-P1500.3Pork-F3000.6Pork-R3000.6Pork-P1500.3DNA模板—1μL每個(gè)物種ddH2O——總體積—20

不足體積以ddH2O補(bǔ)齊。

Polishing the insuffiaent volume with ddH2O.

在圖1A中，利用牛肉的特異性引物和探針擴(kuò)增不同純?nèi)鈽悠返腄NA，純牛肉的樣本中有特異的擴(kuò)增曲線，而其他純?nèi)鈽悠分形从^察到有牛肉特征曲線。同樣在圖1的B、C和D中，相應(yīng)的特異性引物和探針只是在對(duì)應(yīng)的純?nèi)鈽悠分械玫较鄳?yīng)的擴(kuò)增曲線，而在其他純?nèi)鈽悠分形从^察到有特征曲線。試驗(yàn)結(jié)果表明，所選擇的引物和探針具有很好的物種特異性。

A，牛肉的引物和探針的特異性分析結(jié)果；B，雞肉的引物和探針的特異性分析結(jié)果；C，鴨肉的引物和探針的特異性分析結(jié)果；D，豬肉的引物和探針的特異性分析結(jié)果。A，The result of specificity analysis for beef primer and probe; B，The result of specificity analysis for beef primer and probe; C，The result of specificity analysis for beef primer and probe; D，The result of specificity analysis for beef primer and probe.圖1 引物和探針的特異性分析Fig.1 Specificity analysis of primers and probes

2.2 多重?zé)晒舛縋CR分析

利用熒光定量PCR擴(kuò)增優(yōu)化后的多重?cái)?shù)字PCR體系，分析多重?cái)U(kuò)增體系的可擴(kuò)增性。擴(kuò)增體系中含有分別針對(duì)牛、豬、雞和鴨的特異性引物與探針，在擴(kuò)增體系中加入相應(yīng)的DNA模板，分別為牛和豬的DNA，牛和雞的DNA，牛和鴨的DNA，以及同時(shí)含有牛、豬、雞和鴨的DNA。

如圖2所示，在含有相應(yīng)DNA模板的擴(kuò)增體系中，均呈現(xiàn)相應(yīng)的擴(kuò)增曲線。當(dāng)體系中同時(shí)含有牛、豬、雞和鴨的DNA時(shí)，因豬、雞和鴨的探針都是同一熒光標(biāo)記(HEX)，因此對(duì)豬、雞和鴨的擴(kuò)增是同一擴(kuò)增曲線。多重?zé)晒舛縋CR分析結(jié)果表明了多重?cái)U(kuò)增體系的可行性。

2.3 多重?cái)?shù)字PCR擴(kuò)增體系的建立

多重?cái)?shù)字PCR擴(kuò)增體系按表2配制，分別配制4個(gè)反應(yīng)。在Ⅰ反應(yīng)中加入牛和雞的DNA，在Ⅱ反應(yīng)中加入牛和鴨的DNA，在Ⅲ反應(yīng)中加入牛和豬的DNA，在Ⅳ反應(yīng)中同時(shí)加入牛、豬、雞和鴨的DNA。如圖3所示，在FAM通道中，4個(gè)反應(yīng)體系中都擴(kuò)增出牛肉信號(hào)；在HEX通道中，Ⅰ～Ⅳ反應(yīng)中分別擴(kuò)增出相應(yīng)的樣品信號(hào)。在2個(gè)熒光通道中，陽性微滴和陰性微滴區(qū)分很明顯，后期分析中，滿足數(shù)字PCR的分析要求。

同時(shí)分析了反應(yīng)Ⅳ的二維散點(diǎn)圖譜。如圖4所示，從擴(kuò)增結(jié)果看，2個(gè)通道中的反應(yīng)均得到良好擴(kuò)增，且信號(hào)值滿足分析要求。

2.4 多重?cái)?shù)字PCR擴(kuò)增體系對(duì)實(shí)際樣品的檢測(cè)

利用建立的多重?cái)?shù)字PCR對(duì)1～9號(hào)實(shí)際樣品進(jìn)行檢測(cè)分析。由表3可知，在數(shù)字PCR擴(kuò)增中，要求每孔微滴生成數(shù)大于8 000個(gè)才納入統(tǒng)計(jì)分析，含有擴(kuò)增信號(hào)的陽性微滴與未擴(kuò)增的陰性微滴用熒光閾值來區(qū)分，利用QuantaSoft分析各反應(yīng)孔中FAM和HEX的熒光信號(hào)值，通過泊松分布公式計(jì)算出各反應(yīng)中相應(yīng)樣品的拷貝數(shù)。在本試驗(yàn)中，樣品微滴生成數(shù)在15 127～19 397之間。其中1～3號(hào)樣品針對(duì)牛肉成分的FAM通道中，陽性微滴分別為7 244，4 034，3 803，通過QuantaSoft軟件泊松分析，其中牛肉基因組的拷貝數(shù)分別為612，295和287，表明1～3號(hào)樣品中含有牛肉成分；而在HEX通道中沒有檢測(cè)到陽性微滴，表明1～3號(hào)樣品中不含有豬肉、雞肉和鴨肉成分。在4～9號(hào)樣品中，針對(duì)牛肉成分的FAM通道均有相應(yīng)陽性微滴生成，并檢測(cè)出相應(yīng)的牛肉基因組的拷貝數(shù)，而在針對(duì)豬肉、雞肉和鴨肉的HEX通道中，也有相應(yīng)的陽性微滴生成，表明4～9號(hào)樣品中至少含有豬肉、雞肉或鴨肉中的1種肉源成分。檢測(cè)結(jié)果與樣品的已知信息相符合。

圖中鴨肉、豬肉和雞肉指示的分別為相應(yīng)的肉源成分在熒光定量PCR體系中的擴(kuò)增曲線，而鴨、雞、豬指示的是熒光定量PCR體系中同時(shí)含有這3種肉源成分的擴(kuò)增曲線，而牛肉指示的是在所有熒光定量PCR體系中牛肉成分的擴(kuò)增曲線。Duck，pork and chicken indicate the amplification curves of the corresponding meat ingredients in the fluorescence quantitative PCR system，respectively，while the duck，chicken and pork indicate the presence of these three meat ingredients in the fluorescence quantitative PCR system，and the beef indicates the amplification curve of the beef composition in all the fluorescent quantitative PCR systems.圖2 多重?zé)晒舛縋CR分析Fig.2 The result of multiple fluorescence quantitative PCR analysis

圖3 多重?cái)?shù)字PCR擴(kuò)增Fig.3 Amplification of multiple digital PCR

圖4 多重?cái)?shù)字PCR擴(kuò)增的二維散點(diǎn)圖分析Fig.4 Two dimensional(2D)scatter plot of multiple digital PCR amplification

3 討論

目前，基于DNA對(duì)動(dòng)物源性成分分析的方法主要為PCR方法，包括普通PCR方法和實(shí)時(shí)熒光PCR方法，普通PCR方法需要對(duì)擴(kuò)增后的DNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠分析，操作繁雜，歷時(shí)較長，常作定性分析，特異性和靈敏度都有待提高。實(shí)時(shí)熒光PCR省去了瓊脂糖凝膠分析，實(shí)時(shí)分析樣品擴(kuò)增情況的靈敏度較高，若利用Taq-Man探針，其特異性也顯著提高，因此目前廣泛應(yīng)用到肉種鑒別及其他食用安全成分的檢測(cè)。

表3 多重?cái)?shù)字PCR對(duì)實(shí)際樣品的檢測(cè)結(jié)果

Table 3 Detection of actual samples by multiple digital

樣品號(hào)Samplenumber目標(biāo)信號(hào)Targetsignal微滴檢測(cè)Dropletdetection可接受值A(chǔ)ccepted陽性微滴Positives陰性微滴Negatives泊松統(tǒng)計(jì)Poissonstatistics最大值Maximum最小值Minimum1μL中的拷貝數(shù)CopiesperμL1FAM17867724410623626598612HEX17867017867--02FAM18181403414147304286295HEX18181018181--03FAM17591380313788296277287HEX17591017591--04FAM16642323213410263245254HEX166421861645615.111.313.25FAM19397427715120302284293HEX193973609157882502341426FAM1512761109017624593609HEX1512781150467.856.37FAM17047384513202310291301HEX170473583134642872692788FAM19096360115495254238246HEX190962041889214.410.912.69FAM17919339514524255239247HEX179191491777011.48.29.8

然而實(shí)時(shí)熒光PCR在定量分析時(shí)需建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，一方面有些標(biāo)準(zhǔn)品非常昂貴，有的本身就很稀少，難以獲取；另一方面，標(biāo)準(zhǔn)品與檢測(cè)樣品之間的差異也會(huì)影響最終定值。已有研究報(bào)道，在分析牛肉丸中牛肉成分含量時(shí)，由于樣品DNA受各種因素的影響，如牛的性別、年齡、部位及加工過程所采用的加工工藝、配料(增稠劑、防腐劑等)的不同，可能導(dǎo)致牛肉丸中DNA得率不同，導(dǎo)致配制的標(biāo)準(zhǔn)品中牛肉含量與實(shí)際情況不符[12]。為了節(jié)約成本，減少檢測(cè)時(shí)間，有時(shí)需要建立多重檢測(cè)體系，目前主流的熒光PCR儀，一般都有4～5個(gè)不同熒光的通道，理論上可做到同時(shí)針對(duì)4～5個(gè)不同靶標(biāo)的多重實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)。然而，由于在擴(kuò)增時(shí)所有引物和探針及樣品都在同一擴(kuò)增體系中，無法避免彼此間相互干擾，極大影響了多重檢測(cè)的實(shí)際應(yīng)用性。

數(shù)字PCR是繼普通PCR和實(shí)時(shí)熒光PCR后又一革新的PCR技術(shù)，通過將微量樣品進(jìn)行大倍的稀釋和分液，使每個(gè)擴(kuò)增區(qū)域含有目標(biāo)擴(kuò)增分子為0、1或1個(gè)以上，相當(dāng)于將擴(kuò)增體系分成上萬個(gè)獨(dú)立的擴(kuò)增體系，擴(kuò)增后對(duì)擴(kuò)增信號(hào)進(jìn)行泊松分布分析，從而計(jì)算出樣本的最初拷貝數(shù)或濃度，做到對(duì)檢測(cè)樣品的絕對(duì)定量，而且不需要建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，由于只是針對(duì)擴(kuò)增信號(hào)有和無的分析，對(duì)PCR的擴(kuò)增效率要求不高，從而對(duì)樣品的耐受性更高。另一方面，由于其對(duì)起始擴(kuò)增體系進(jìn)行多倍分液，適合建立多重檢測(cè)體系，進(jìn)行分液或是隔離后，不同靶標(biāo)的擴(kuò)增還是在各自獨(dú)立的體系中擴(kuò)增，相互間干擾較少。

本研究利用數(shù)字PCR的這些特點(diǎn)，建立了針對(duì)牛、豬、雞和鴨肉的多重檢測(cè)，可同時(shí)檢測(cè)這4種肉源性成分，且能絕對(duì)定量到相應(yīng)的拷貝數(shù)。目前其主要不足表現(xiàn)在兩個(gè)方面，一是由于目前的數(shù)字PCR儀只能分析2個(gè)通道的熒光，如Bio-Rad的微滴式生成數(shù)字PCR，只能分析FAM和HEX這兩個(gè)通道。因此在本研中，對(duì)豬、雞和鴨肉成分利用HEX標(biāo)記檢測(cè)，雖能對(duì)這3種成分進(jìn)行檢測(cè)分析，但不能將這3種成分進(jìn)行區(qū)分。盡管目前也有研究利用EvaGreen熒光分析擴(kuò)增，通過擴(kuò)增后不同擴(kuò)增靶標(biāo)的熒光值的不同來區(qū)分不同靶標(biāo)，從而提高數(shù)字PCR通量[13]，但這種方法需要篩選適合的引物及復(fù)雜的體系調(diào)配，同時(shí)其特異性也有待提高。另一方面，雖然本研究建立的方法能獲得肉源成分的絕對(duì)拷貝數(shù)，但目前還不能通過對(duì)樣品中不同肉源性成分的DNA拷貝數(shù)比來計(jì)算出其組分的質(zhì)量比。隨著數(shù)字PCR及其他分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展和日趨完善，數(shù)字PCR技術(shù)在動(dòng)物源性成分檢測(cè)及其他領(lǐng)域?qū)?huì)具有更大的應(yīng)用前景。

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(責(zé)任編輯 張瑞麟)

Rapid detection of chicken，duck and pork blending in beef products by multiple digital PCR

YANG Hua， WANG Xiaofu， XIAO Yingping， WEI Wei，XU Junfeng

(InstituteofQualityandStandardforAgro-products,ZhejiangAcademyofAgriculturalSciences，Hangzhou310021，China)

In this study，a quickly detective method，using droplet digital PCR，for detection of beef，chicken，duck and pork was established. The results showed that the selected primers and probes for the four species had good specificity，and could quickly make out these four kinds of mean component in tested samples. In all of the digital PCR analysis， the fluorescence signals of FAM and HEX can be well distinguished. For detection of 9 samples，the numbers of droplets generated in the multiple digital PCR were all above 10 000， which could meet the requirements for the poisson formula analysis in digital PCR. meanwhile，the test results of the 9 samples using multiple digital were consistent with the known information of these samples.

digital PCR；meat components detection；multiple detection；quickly detection

10.3969/j.issn.1004-1524.2017.06.20

2017-04-24

浙江省自然科學(xué)基金(LZ15C170001)

楊華(1972—)，男，浙江紹興人，碩士，高級(jí)畜牧師，主要從事畜產(chǎn)品質(zhì)量安全研究。E-mail: yanghua806@hotmail.com

Q-331

A

1004-1524(2017)06-0994-07