黃顙魚源海豚鏈球菌分離、鑒定及藥敏特性

楊移斌，胥 寧，楊秋紅，劉永濤，董 靖，艾曉輝，*

(1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院 長江水產(chǎn)研究所，湖北 武漢 430223； 2.淡水水產(chǎn)健康養(yǎng)殖湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北 武漢 430223)

黃顙魚源海豚鏈球菌分離、鑒定及藥敏特性

楊移斌1，2，胥 寧1，2，楊秋紅1，2，劉永濤1，2，董 靖1，2，艾曉輝1，2，*

(1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院 長江水產(chǎn)研究所，湖北 武漢 430223； 2.淡水水產(chǎn)健康養(yǎng)殖湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北 武漢 430223)

為探明福建漳州某養(yǎng)殖場(chǎng)暴發(fā)黃顙魚大量死亡的病因，為該疫病的防控提供參考。從患病黃顙魚肝、腎及脾分離純化病原菌，經(jīng)理化特性測(cè)定及16S rRNA 序列分析對(duì)其進(jìn)行鑒定，開展人工感染試驗(yàn)，并利用紙片擴(kuò)散法進(jìn)行藥敏特性分析。結(jié)果顯示，分離菌株si222對(duì)黃顙魚的LD50為2.63×104cfu·g-1，其理化特性與海豚鏈球菌(Streptococcusiniae)基本一致，16S rRNA序列與海豚鏈球菌同源性為100%，綜合判定分離菌株為海豚鏈球菌。菌株si222對(duì)苯唑西林、頭孢拉定、克林霉素及氯霉素利福平等11種抗生素高度敏感；對(duì)青霉素、阿莫西林、磺胺異噁唑及氟苯尼考等6種抗生素耐藥。分離菌株si222是黃顙魚病原菌，養(yǎng)殖時(shí)可選用慶大霉素及多西環(huán)素等藥物進(jìn)行防控。

海豚鏈球菌；黃顙魚；人工感染；藥敏特性

黃顙魚(Pelteobagrusfulvidraco)，俗稱黃臘丁等，其分類地位為鯰形目(Siluriformes)、鲿科(Bagridae)、黃顙魚屬(Pelteobagrus)[1]。黃顙魚是重要的淡水經(jīng)濟(jì)魚類，其肉質(zhì)鮮美，富含多種營養(yǎng)成分，又無肌間刺，深受廣大消費(fèi)者喜愛。黃顙魚是廣溫性魚類，能適應(yīng)中國大部分地區(qū)養(yǎng)殖環(huán)境，故黃顙魚近年來在國內(nèi)養(yǎng)殖區(qū)域、規(guī)模及密度不斷擴(kuò)大。隨著黃顙魚養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展，養(yǎng)殖規(guī)模及密度不斷增加，導(dǎo)致黃顙魚養(yǎng)殖水域環(huán)境急劇變化，養(yǎng)殖黃顙魚不斷出現(xiàn)各種病害。

目前報(bào)道的黃顙魚細(xì)菌病原主要有遲鈍愛德華氏菌(Edwardsiellatarda)[2]、鮰愛德華氏菌(Edwardsiellaictaluri)[3]、嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophilia)[4]、維氏氣單胞菌(Aeromonasveronii)[5]、溫和氣單胞菌(Aeromonassobria)[6]、柱狀黃桿菌(Flavobacteriumcolumnare)[7]及蠟狀芽孢桿菌(Bacilluscereus)[8]等，病原的多樣性常導(dǎo)致病害難以及時(shí)有效防控，從而引起較大經(jīng)濟(jì)損失，故病害成為了黃顙魚養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的一大障礙。

2016年7至8月福建漳州某黃顙魚養(yǎng)殖場(chǎng)暴發(fā)養(yǎng)殖黃顙魚大量死亡，發(fā)病率在40%～60%，病魚死亡率接近90%，發(fā)病黃顙魚在口腔與下頜、體表兩側(cè)及鰭條基部均有出血癥狀，肛門紅腫有紅色液體流出；解剖可見肝腎脾等出現(xiàn)腫脹、充血，部分病魚有腹水，本研究在發(fā)病黃顙魚體內(nèi)分離到1株優(yōu)勢(shì)菌，進(jìn)行了人工感染實(shí)驗(yàn)及鑒定，確定了分離菌株的種類，并對(duì)其藥物敏感特性進(jìn)行了測(cè)定，以期為該病的有效防控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)魚

帶有典型癥狀的發(fā)病黃顙魚8尾采自福建漳州黃顙魚養(yǎng)殖場(chǎng)；健康黃顙魚(30±1.5)g購于武漢某水產(chǎn)市場(chǎng)，健康黃顙魚無傷病，活力強(qiáng)，暫養(yǎng)于實(shí)驗(yàn)室魚缸7 d后無異常。

1.1.2 試劑及儀器

水解酪蛋白瓊脂(MH)、腦心浸出液(BHI)及其瓊脂培養(yǎng)基(BHIA)、革蘭氏染色液、藥敏紙片及細(xì)菌生化微量鑒定管購自杭州微生物試劑有限公司；PCR所用試劑、特異性引物及細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒均購自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 臨床調(diào)查

對(duì)暴發(fā)死亡黃顙魚養(yǎng)殖場(chǎng)養(yǎng)殖環(huán)境、發(fā)病史進(jìn)行調(diào)查。

1.2.2 病原菌分離

取具有典型癥狀病魚8尾，在無菌條件下，取肝、腎、脾畫線于腦心浸出液平板上，置于恒溫28 ℃培養(yǎng)1～3 d，挑取形狀、大小及顏色基本一致的菌落用于再純化，最終獲得分離菌株的純培養(yǎng)物。純培養(yǎng)物加入25%的甘油混勻后置于-80 ℃保存。分離菌株暫命名為si222。

1.2.3 人工感染及LD50測(cè)定

人工感染。將si222菌株接種于BHIA培養(yǎng)基上， 放置在28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中36 h，用無菌生理鹽水洗下菌苔，并參照麥?zhǔn)媳葷岱ㄕ{(diào)整菌懸液濃度為4.5×108cfu·mL-1。

將感染黃顙魚分為兩組，每組均設(shè)置3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)10尾魚[10]。連續(xù)充氧，水溫控制在25～28 ℃。實(shí)驗(yàn)組黃顙魚腹腔注射si222菌液0.1 mL·尾-1，對(duì)照組腹腔注射等量無菌生理鹽水。間隔3 h觀察黃顙魚游泳狀況，對(duì)發(fā)病死亡魚進(jìn)行解剖觀察，并進(jìn)行細(xì)菌再分離。

細(xì)菌LD50測(cè)定。將分離菌株制成濃度為2.5×109、2.5×108、2.5×107、2.5×106、2.5×105cfu·mL-1的菌懸液，分別注射到不同組黃顙魚體內(nèi)，每尾0.1 mL，即各組每尾注射劑量分別為2.5×108、2.5×107、2.5×106、2.5×105、2.5×104cfu，對(duì)照組注射等量無菌生理鹽水，每組的實(shí)驗(yàn)魚各10尾。持續(xù)觀察實(shí)驗(yàn)魚的活動(dòng)情況，及時(shí)記錄發(fā)病死亡數(shù)，并用概率單位圖解法[11]計(jì)算半致死劑量(LD50)。

1.2.4 生理生化特性測(cè)定

將分離菌株在BHIA平板上畫線，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36 h后，觀察菌落大小、形態(tài)特征及其顏色，并進(jìn)行革蘭氏染色，采用細(xì)菌生化微量鑒定參照《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(cè)》[12]測(cè)定生理生化指標(biāo)。

1.2.5 分離菌株16S rRNA基因序列測(cè)定及系統(tǒng)發(fā)育分析

將分離菌株接種于BHI，置于搖床恒溫28 ℃培養(yǎng)24 h，菌液經(jīng)高速離心后收集菌體，提取DNA作為PCR擴(kuò)增模板。細(xì)菌16S rDNA序列擴(kuò)增通用引物為27F: 5′-AGAGTTTGATC(C/A)TGGCTCAG-3′；1492R: 5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。參照王小亮等[10]方法進(jìn)行PCR反應(yīng)擴(kuò)增目的基因。擴(kuò)增產(chǎn)物確定為目的片段后送生工生物工程(上海)股份有限公司純化及序列測(cè)定。

將si222株16S rDNA基因序列放到NCBI中進(jìn)行比對(duì)，根據(jù)比對(duì)結(jié)果下載同源性較高的序列采用Clustal X軟件進(jìn)行多序列匹配分析，通過MEGA5.1軟件Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，1 000次Bootstrap檢驗(yàn)置信度。

1.2.6 藥敏特性分析

藥敏實(shí)驗(yàn)采用紙片瓊脂擴(kuò)散法，參照NCCLS抗微生物藥物敏感性實(shí)驗(yàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)[13]進(jìn)行。將分離菌株接種于腦心浸出液培養(yǎng)基，28 ℃振蕩培養(yǎng)24 h，用無菌生理鹽水調(diào)整菌懸液濃度為2.0×107cfu·mL-1，取200 μL菌液均勻涂于MH平板上，貼上不同的藥敏紙片，28 ℃培養(yǎng)24 h后測(cè)量藥物抑菌圈直徑，參照杭州微生物公司藥敏紙片說明書進(jìn)行敏感度判定。

2 結(jié)果與分析

2.1 臨床調(diào)查

自然發(fā)病黃顙魚養(yǎng)殖場(chǎng)養(yǎng)殖面積約6.67 hm2，放養(yǎng)密度為18 g苗30萬尾·hm-2，單養(yǎng)黃顙魚，其所處區(qū)域黃顙魚養(yǎng)殖近200 hm2，其中養(yǎng)殖場(chǎng)發(fā)病2.67～4.00 hm2，發(fā)病期持續(xù)近1個(gè)月，死亡率達(dá)到90%，導(dǎo)致嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。發(fā)病池水溫26～28 ℃，氨氮0.3 mg·L-1，亞硝酸鹽0.05 mg·L-1。

2.2 細(xì)菌分離與致病性分析

從患病黃顙魚肝、腎及脾中分離到一株優(yōu)勢(shì)菌si222。經(jīng)人工感染實(shí)驗(yàn)，注射濃度為4.5×108cfu·mL-1si222菌液的實(shí)驗(yàn)組黃顙魚第1天即出現(xiàn)死亡，3 d內(nèi)死亡率達(dá)100%，而對(duì)照組未出現(xiàn)異常。感染發(fā)病死亡黃顙魚出現(xiàn)體表出血，內(nèi)臟嚴(yán)重充血腫大等癥狀，與自然發(fā)病癥狀相似，如圖1所示，并且細(xì)菌再分離實(shí)驗(yàn)獲得了與菌株si222相同的菌株，表明菌株si222是黃顙魚的病原菌。參照表1建立的實(shí)驗(yàn)魚死亡率(%)與細(xì)菌劑量對(duì)數(shù)[lg(cfu)]的關(guān)系曲線：y=0.22x-0.808(圖2)，分離菌株si222對(duì)黃顙魚半數(shù)致死劑量LD50=7.9×105cfu·尾-1，即LD50=2.63×104cfu·g-1。

圖1 自然發(fā)病(A)和人工感染(B)黃顙魚解剖圖Fig.1 The anatomical image for natural sicked (A) and artificial infected (B) Pelteobagrus fulvidraco

表1 分離株對(duì)黃顙魚LD50試驗(yàn)結(jié)果

Table 1 Results of LD50of isolated strain inPelteobagrusfulvidraco

組別Group細(xì)菌劑量Injecteddose/(cfu·fish-1)實(shí)驗(yàn)魚數(shù)量Fishnumber死亡數(shù)量Amountofdeath1d2d3d4d5d6d7d死亡率Mortality/%A2.5×108108200000100B2.5×10710531000090C2.5×10610211000060D2.5×10510011100030E2.5×10410000110020F0.65%生理鹽水Physiologicalsaline1000000000

圖2 黃顙魚死亡率與細(xì)菌劑量對(duì)數(shù)的關(guān)系曲線Fig.2 The relation curve of Pelteobagrus fulvidraco mortality with logarithm of bacterial dose

2.2 細(xì)菌鑒定

分離菌株si222革蘭氏染色呈現(xiàn)藍(lán)紫色，表明分離菌株為革蘭氏陽性菌，在腦心浸出液平板上28 ℃培養(yǎng)48 h的菌落為白色、透明、圓形、直徑為0.2～0.8 mm。具體生理生化指標(biāo)如表2，生理生化指標(biāo)測(cè)定結(jié)果初步判斷si222菌株為海豚鏈球菌Streptococcusiniae。將菌株si222的16S rRNA基因序列與NCBI中已有16S rRNA序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果顯示，si222株與鏈球菌屬種類同源性最高，選取同源性高的鏈球菌屬16S rRNA序列，通過構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹分析(圖3)，其結(jié)果顯示，si222株與海豚鏈球菌Streptococcusiniae聚為一支，同源性最高，為100%。因此結(jié)合生理生化特性將si222株判定為海豚鏈球菌Streptococcusiniae。

表2 菌株si222的生理生化試驗(yàn)結(jié)果

Table 2 Results of biochemical characteristics of strain si222

試驗(yàn)項(xiàng)目Testitemssi222海豚鏈球菌[10]Streptococcusiniae試驗(yàn)項(xiàng)目Testitemssi222海豚鏈球菌[10]StreptococcusiniaeVp試驗(yàn)Vpexperiment--蜜二糖Melibiose--脲酶Urease--菊糖Inulin--水解七葉靈++蔗糖Sucrose++Hydrolysisofesculin氧化酶Oxidase--葡萄糖Glucose++阿拉伯糖Arabinose--海藻糖Trehalose++水楊苷Salicin++D-木糖D-xylose++乳糖Lactose--甘油醇Glycols++接觸酶Catalase--山梨醇Sorbitol--45℃生長45℃growth--核糖Ribose++10℃生長10℃growth++

“+”，陽性； “-”，陰性。

“+”， Positive； “-”， Negative.

圖3 基于si222株和其他相關(guān)菌株16S rRNA 基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree based on 16S rRNA gene sequence of si222 strain and its relative strains

2.3 藥敏特性

藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，分離菌株si222對(duì)苯唑西林、頭孢拉定、克林霉素及利福平等11種抗生素高度敏感；對(duì)青霉素、阿莫西林、磺胺異噁唑及氟苯尼考等6種抗生素耐藥。具體見表3。

表3 si222藥敏試驗(yàn)結(jié)果

Table 3 Antibiotic sensitivity test of strain si222

藥物Drug抑菌圈直徑判斷標(biāo)準(zhǔn)Thestandardofinhibitionzonediameter/mm不敏感Resistant中度敏感Mediumsensitive高度敏感Highlysensitive藥物含量Dose/(μg·disc-1)抑菌圈直徑Inhibitionzonediameter/mm敏感性Sensitivity苯唑西林Oxacillin≤1011～12≥13118S青霉素Penicillin≤1920～27≥2810U19R頭孢拉定Cefadroxil≤1415～17≥183029S阿莫西林Amoxicillin≤1314～17≥182013R磺胺異噁唑Sulfisoxazole≤1213～16≥173000R氟苯尼考Florfenicol≤1213～17≥18750R克林霉素Clindamycin≤1415～20≥21232S利福平Rifampicin≤1617～19≥20534S頭孢噻肟Cefotaxime≤1415～22≥233035S新霉素Neomycin≤1213～16≥173024S卡那霉素Kanamycin≤1314～17≥18300R多西環(huán)素Doxycycline≤1213～15≥163030S左氧氟沙星Levofloxacin≤1314～16≥17520S鏈霉素Streptomycin1≤1112～14≥151022S妥布霉素Tobramycin≤1213～14≥15100R慶大霉素Gentamicin≤1213～14≥151023S阿米卡星Amikacin≤1415～16≥173029S

S，高度敏感；R，耐藥；U，青霉素的含量以單位計(jì)。

S， Highly sensitive; R， Resistant; U， Penicillin content measures in unit.

3 討論

隨著黃顙魚養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)不斷發(fā)展，養(yǎng)殖環(huán)境日益惡化，細(xì)菌性病害頻發(fā)。本研究從自然發(fā)病黃顙魚體內(nèi)分離到致病菌，通過形態(tài)學(xué)、理化特性及16S rRNA基因分析，綜合判定分離菌株si222為海豚鏈球菌(Streptococcusiniae)，通過回歸感染實(shí)驗(yàn)，確定海豚鏈球菌為黃顙魚病原菌。

海豚鏈球菌分類地位為芽孢桿菌綱、乳桿菌目、鏈球菌科、鏈球菌屬[14]，1976年由Pier和Madin[15]從美國舊金山市某水族館一頭亞馬孫淡水海豚皮下膿腫中首次分離并定種。其流行區(qū)域及可感染魚種類多樣，目前已經(jīng)報(bào)道的種類有雜交鱘[10]、西伯利亞鱘[16]、羅非魚[17]、鱸魚[18]、雜交鱧[19]、斑點(diǎn)叉尾鮰[14]及半滑舌鰨[20]等，給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大經(jīng)濟(jì)損失。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道海豚鏈球菌感染不同種類宿主其主要癥狀具有一定的差異[16]，在感染哺乳動(dòng)物時(shí)主要表現(xiàn)蜂窩組織炎、腦膜炎及皮下膿腫等，而在魚類主要表現(xiàn)為眼球突出、全身性敗血及腦膜炎等[21]。本研究發(fā)現(xiàn)海豚鏈球菌自然感染黃顙魚導(dǎo)致其體表及重要組織器官出現(xiàn)以出血及病變?yōu)橹饕卣鞯臄⊙Y狀，符合海豚鏈球菌感染魚類致病的癥狀，目前國內(nèi)未見相關(guān)的系統(tǒng)報(bào)道。鏈球菌在養(yǎng)殖環(huán)境中是普遍存在的[22]，發(fā)病與養(yǎng)殖水溫、養(yǎng)殖環(huán)境及養(yǎng)殖密度有著密切的關(guān)系，一般認(rèn)為水溫在25 ℃及以上鏈球菌就會(huì)導(dǎo)致水生動(dòng)物發(fā)病[23]。福建漳州地區(qū)養(yǎng)殖黃顙魚規(guī)模大，集約化程度高，導(dǎo)致養(yǎng)殖密度高、環(huán)境差，而每年的7—8月份養(yǎng)殖水溫都遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過25 ℃，適合鏈球菌的生長繁殖。

對(duì)于細(xì)菌鑒定目前通用的方法主要有傳統(tǒng)生理生化特征測(cè)定、細(xì)菌自動(dòng)鑒定儀及16S rRNA基因鑒定。由于當(dāng)今商業(yè)細(xì)菌鑒定儀都沒有收錄海豚鏈球菌，故不能使用此法進(jìn)行海豚鏈球菌鑒定[16]，而細(xì)菌不同鑒定方法各有優(yōu)勢(shì)和缺陷，科學(xué)鑒定方法一般是將測(cè)定細(xì)菌理化特征及16S rRNA基因分析結(jié)合起來[24]。本研究在革蘭氏染色觀察及形態(tài)學(xué)研究結(jié)果基礎(chǔ)上，參照《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(cè)》鏈球菌屬理化指標(biāo)，通過微量生化反應(yīng)管測(cè)定了海豚鏈球菌的理化特性；并對(duì)分離菌株si222的16S rRNA基因進(jìn)行擴(kuò)增及測(cè)序，進(jìn)行Blast比對(duì)及系統(tǒng)發(fā)育分析，結(jié)合二者的優(yōu)勢(shì)，綜合鑒定分離菌株si222為海豚鏈球菌，結(jié)果準(zhǔn)確、科學(xué)、客觀。

本研究測(cè)定了分離菌株si222對(duì)苯唑西林、頭孢拉定、克林霉素及利福平等11種抗生素高度敏感；對(duì)青霉素、阿莫西林、磺胺異噁唑及氟苯尼考等6種抗生素耐藥。實(shí)驗(yàn)結(jié)果中菌株si222對(duì)阿莫西林、氟苯尼考及諾氟沙星等耐藥，與鄧夢(mèng)玲等[16]研究結(jié)果不同；菌株si222對(duì)慶大霉素、多西環(huán)素等高度敏感與鄧夢(mèng)玲等[16]、陳言峰等[19]報(bào)道相同。藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果存在差異，可能是因?yàn)榫陙碓础⒌乩憝h(huán)境及用藥情況等不同造成的。根據(jù)藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇水產(chǎn)用多西環(huán)素參照說明書使用，連續(xù)伴餌投喂7 d停止死亡，經(jīng)觀察后養(yǎng)殖黃顙魚逐步恢復(fù)正常。雖然目前在水生動(dòng)物病害治療時(shí)，藥物治療仍然是治愈病害的主要手段之一，但隨著各種細(xì)菌性病害暴發(fā)，藥物濫用，耐藥菌株不斷產(chǎn)生，而且在環(huán)境中還會(huì)形成殘留，給養(yǎng)殖戶有效防控水生動(dòng)物病害帶來困難同時(shí)帶來環(huán)境問題。為此，在疾病診斷時(shí)應(yīng)及時(shí)鑒定病原，了解病原的耐藥性，尋找高度敏感藥物，從而做到科學(xué)用藥，保障水產(chǎn)品質(zhì)量安全。

[1] 丁瑞華. 四川魚類志[M]. 成都：四川科學(xué)技術(shù)出版社，1994.

[2] 鄧先余，羅文，譚樹華，等. 黃顙魚(Pelteobagrusfulvidraco)“紅頭病”病原菌遲鈍愛德華氏菌(Edwardsiellatarda)的分離及鑒定[J]. 海洋與湖沼，2008，39(5)：511-516. DENG X Y， LUO W， TAN S H， et al. Isolation and of bacteriosis pathogen-Edwardsiellatardafrom yellow catfish(Pelteobagrusfulvidraco)with red head disease [J].ChineseJournalofOceanogrphyandLimnology， 2008， 39(5)：511-516.(in Chinese with English abstract)

[3] 耿毅，汪開毓，范方玲，等. 養(yǎng)殖黃顙魚(Pelteobagrusfulvidraco)愛德華氏菌(Edwardsiellaictaluri)的分離鑒定[J]. 海洋與湖沼，2010，41(1)：61-67. GENG Y， WANG K Y， FAN F L， et al. Isolation， identification and biological characterization ofEdwardsiellaictalurifrom yellow cartfishPelteobagrusfulvidraco[J].OceanologiaetLimnologiaSinica， 2010， 41(1)：61-67.(in Chinese with English abstract)

[4] 胡宗云，宋文華，張濤，等. 黃顙魚“紅頭病”病原菌蠟狀芽孢桿菌分離鑒定及藥敏分析[J]. 水產(chǎn)學(xué)雜志，2016，29(4)：33-37. HU Z Y， SONG W H， ZHANG T， et al. Identification and drug sensitivity test of pathogenBacilluscereusfrom yellow catfish (Pelteobagrusfulvidraco) with Red-head Disease [J].ChineseJournalofFisheries， 2016， 29(4)：33-37.(in Chinese with English abstract)

[5] 梁正生，黃鈞，施金谷，等. 黃顙魚腹水病病原菌的分離鑒定及藥敏試驗(yàn)[J]. 南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2012，43(9)：1400-1404. LIANG Z S， HUANG J， SHI J G， et al. Isolation and identification of ascites disease pathogen fromPelteobagrusfulvidracoRichardson and its drug sensitivity test [J].JournalofSouthernAgriculture， 2012， 43(9)：1400-1404.(in Chinese with English abstract)

[6] 徐洋，藺凌云，姚嘉赟，等. 黃顙魚“潰瘍綜合征”病原的分離鑒定及藥敏試驗(yàn)[J]. 淡水漁業(yè)，2015，45(5)：100-104. XU Y， LIN L Y， YAO J Y， et al. Pathogen isolation， identification and susceptibility test of Ulcerative Disease Syndrome onPelteobagrusfulvidraco[J].FreshwaterFisheries， 2015， 45(5)：100-104.(in Chinese with English abstract)

[7] 黃鈞，溫華成，施金谷，等. 黃顙魚體表潰瘍病病原菌分離鑒定及藥敏試驗(yàn)[J]. 南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2012，43(1)：107-112. HUANG J， WEN H C， SHI J G， et al. Isolation and identification of pathogenic bacteria fromPelteobagrusfulvidracoulcerative syndrome and its drug sensitive test [J].JournalofSouthernAgriculture， 2012， 43(1)：107-112.(in Chinese with English abstract)

[8] 張玉蕾，趙麗娟，周偉東，等. 黃顙魚源柱狀黃桿菌的分離鑒定及其對(duì)翹嘴鱖的致病性[J]. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2016(2)： 83-89. ZHANG Y L， ZHAO L J， ZHOU W D， et al. Characterization and pathogenicity of a strain ofFlavobacteriumcolumnareisolated fromPelteobagrusfulvidraco[J].JournalofHuazhongAgriculturalUniversity， 2016(2)：83-89.(in Chinese with English abstract)

[9] 祝璟琳，楊弘，鄒芝英，等. 海南養(yǎng)殖羅非魚(Oreochromisniloticus)致病鏈球菌的分離、鑒定及其藥敏試驗(yàn)[J]. 海洋與湖沼，2010，41(4)：590-596. ZHU J L， YANG H， ZOU Z Y， et al. Isolation， identification and drug sensitivity test of pathogenic streptococcus from tilapiasoreochromisniloticuscultured in Hainan [J].OceanologiaetLimnologiaSinica， 2010， 41(4)：590-596. (in Chinese with English abstract)

[10] 王小亮，徐立蒲，王靜波，等. 雜交鱘海豚鏈球菌的分離、鑒定及藥物敏感性[J]. 微生物學(xué)報(bào)，2014，54(4)：442-448. WANG X L， XU L P， WANG J B， et al. Isolation， identification and drug sensitivity ofStreptococcusiniaefrom hybrid sturgeons (Husodauricusfemale×Acipenserschrenckimale) [J].ActaMicrobiologicaSinica， 2014， 54(4)：442-448.(in Chinese with English abstract)

[11] 徐叔云，卞如濂，陳修. 藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)[M]. 北京：人民衛(wèi)生出版社，2002.

[12] WHILEY R A， HARDIE J M， Genus I.Streptococcusosenbach 1884， 22AL [M]// DE VOS P， GARRITY G M， JONES D， et al. Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology， Vol. 3， 2nd ed. New York: Springer， 2009: 655-711.

[13] WIKLERi M A. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing [S]. 19th ed. Clinical Laboratory Standards Institute， 2009.

[14] 陳德芳. 斑點(diǎn)叉尾鮰海豚鏈球菌病病原學(xué)，病理學(xué)和診斷方法研究[D]. 雅安：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，2011. CHEN D F. Study on etiology， pathology and diagnostic method of theStreptococcusiniaeinfection in Channel catfishIetalurusPunctatus[D]. Ya’an:SichuanAgriculturalUniversity， 2011.(in Chinese with English abstract)

[15] PIER G， MADIN S.Streptococcusiniaesp. nov.， a beta-hemolyticstreptococcusisolated from an Amazon freshwater dolphin，Iniageoffrensis[J].InternationalJournalofSystematicBacteriology， 1976， 26(4)：545-553.

[16] 鄧夢(mèng)玲，耿毅，劉丹，等. 西伯利亞鱘海豚鏈球菌的分離鑒定及毒力基因檢測(cè)[J]. 水產(chǎn)學(xué)報(bào)，2015，39(1)：127-135. DENG M L， GENG Y， LIU D， et al. Isolation， identification and detection of virulence genes ofStreptococcusiniaefromAcipenserbaerii[J].JournalofFisheriesofChina， 2015， 39(1)：127-135.(in Chinese with English abstract)

[17] 甘西，陳明，余曉麗，等. 羅非魚海豚鏈球菌16S rRNA基因的序列測(cè)定和系統(tǒng)進(jìn)化分析[J]. 水產(chǎn)學(xué)報(bào)，2007，31(5)：618-623. GAN X， CHEN M， YU X L， et al. Sequencing and phylogenetic analysis of the 16S rRNA gene ofStreptococcusiniae[J].JournalofFisheriesofChina， 2007， 31(5)：618-623.(in Chinese with English abstract)

[18] 張俊，周素明，李安興. 廣東省養(yǎng)殖羅非魚、海鱸、尖吻鱸海豚鏈球菌感染調(diào)查[J]. 中國水產(chǎn)科學(xué)，2012，19(1)：161-166. ZHANG J， ZHOU S M， LI A X. The survey ofStreptococcusiniaeinfection ofOreochromisspp.，LateolabraxjaponicusandLatescalcariferfrom Guangxi [J].JournalofFisherySciencesofChina， 2012， 19(1)：161-166.(in Chinese with English abstract)

[19] 陳言峰，周愛國，鄒青，等. 雜交鱧海豚鏈球菌病病原分離鑒定及藥敏試驗(yàn)[J]. 南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2015，46(2)：332-337. CHEN Y F， ZHOU A G， ZOU Q， et al. Isolation and identification of pathogenStreptococcusiniaein diseased hybrid snakehead (Channaargus♂×Channamaculata♀) [J].JournalofSouthernAgriculture， 2015， 46(2)：332-337.(in Chinese with English abstract)

[20] 徐曉麗，尤宏?duì)帲侮砾i，等. 半滑舌鰨腹水癥病原的分離鑒定[J]. 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2015，46(3)：74-80. XU X L， YOU H Z， SONG Y P， et al. Isolation and identification of pathogenic bacterium associated with ascites inCynoglossussemilaevisis[J].JournalofNortheastAgriculturalUniversity， 2015， 46(3)：74-80.(in Chinese with English abstract)

[21] AGNEW W， BARNES A C.Streptococcusiniae: An aquatic pathogen of global veterinary significance and a challenging candidate for reliable vaccination [J].VeterinaryMicrobiology， 2007， 122(1/2)：1-15.

[22] SAKO H. A comparative study on the properties and pathogenicties of beta-hemolyticStreptococcussp. isolated from marine and freshwater fishes [J].AquacultureScience， 1993， 41(3)：387-395.

[23] YUASA K， KITANCHAROEN N， KATAOKA Y， et al.Streptococcusiniae， the causative agent of mass mortalityin rabbitfishSiganuscanaliculatusin Bahrain [J].JournalofAquaticAnimalHealth， 1999, 11(1)：87-93.

[24] 楊寧，姜芳燕，黃海，等. 羅非魚(Tilapianilotica)簡達(dá)氣單胞菌病的病原分離鑒定及藥敏試驗(yàn)[J]. 漁業(yè)科學(xué)進(jìn)展，2015， 36(4)：83-88. YANG N，JIANG F Y，HUANG H，et al. Isolation，identification and drug sensitive test ofAeromonasjandaeifrom tilapia(Tilapianilotica)[J].ProgressinFisherySciences， 2015， 36(4)：83-88.(in Chinese with English abstract)

(責(zé)任編輯 盧福莊)

Isolation， identification and antibiotic sensitivity ofStreptococcusiniaefromPelteobagrusfulvidraco

YANG Yibin1，2， XU Ning1，2， YANG Qiuhong1，2， LIU Yongtao1，2， DONG Jing1，2， AI Xiaohui1，2，*

(1.YangtzeRiverFisheriesResearchInstitute，ChineseAcademyofFisherySciences，Wuhan430223，China; 2.HubeiFreshwaterAquacultureCollaborativeInnovationCenter，Wuhan430223，China)

The study was aimed to investigate the cause about the outbreak of numerous deaths ofPelteobagrusfulvidracoat a fishery farm in Zhangzhou， Fujian Province， and to provide reference for the prevention and control of the disease forPelteobagrusfulvidraco. The pathogenic bacteria were isolated and purified from liver， kidney and spleen of sickPelteobagrusfulvidraco. And the identification of the strain si222 was conducted， using the biochemical identification and 16S rRNA gene sequence determination. The artificial infection test was performed， and the antimicrobial susceptibility test was conducted by disc diffusion method. The results showed that strain si222 was the pathogens ofPelteobagrusfulvidraco， the LD50of the isolate was counted to 2.63×104cfu·g-1. According to morphological and biochemical characteristics as well as the result of 16S rRNA gene sequence analysis， the isolated strain si222 wasStreptococcusiniae. Strain si222 was susceptible to oxacillin， cefadroxil， clindamycin and rifampicin and other 11 kinds of antibiotics. Meanwhile， it showed resistance to penicillin， amoxicillin， sulfisoxazole， florfenicol and other 6 kinds of antibiotics. The isolated strain si222 was the pathogenic bacteria toPelteobagrusfulvidraco， and the disease can be prevented by administering drugs such as gentamicin and doxycycline in fisheries farming.

Streptococcusiniae;Pelteobagrusfulvidraco; artificial infection; antibiotic sensitivity

10.3969/j.issn.1004-1524.2017.06.07

2016-12-13

公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)(201203085)

楊移斌(1988—)，男，江西撫州人，碩士，助理研究員，從事水生動(dòng)物醫(yī)學(xué)研究。E-mail: yangyb1988@126.com

*通信作者，艾曉輝，E-mail: aixh@yfi.ac.cn

S941.42

A

1004-1524(2017)06-0903-07