浙江省三地區冷鮮雞中大腸埃希菌耐藥譜測定及MLST分子分型分析

楊 華，何祥祥，3，肖英平，錢鳴蓉，張巧艷，唐 標，*

(1.浙江省農業科學院 農產品質量標準研究所，浙江 杭州 310021； 2.浙江省植物有害生物防治省部共建國家重點實驗室培育基地，浙江 杭州310021； 3.西北農林科技大學 食品科學與工程學院，陜西 楊凌 712100)

浙江省三地區冷鮮雞中大腸埃希菌耐藥譜測定及MLST分子分型分析

楊 華1，2，何祥祥1，2，3，肖英平1，2，錢鳴蓉1，2，張巧艷1，唐 標1，2，*

(1.浙江省農業科學院 農產品質量標準研究所，浙江 杭州 310021； 2.浙江省植物有害生物防治省部共建國家重點實驗室培育基地，浙江 杭州310021； 3.西北農林科技大學 食品科學與工程學院，陜西 楊凌 712100)

大腸埃希菌是食品中普遍污染的條件致病菌，其耐藥性非常嚴重，耐藥基因具有極大的傳播風險。為了解浙江省地區禽源大腸埃希菌耐藥性特點及分布規律，試驗從浙江省3個地區市售冷鮮雞中分離了59株大腸埃希菌并測定了耐藥譜，發現有24種耐藥譜，顯示了分離株耐藥類型的多樣性。同時對分離株進行了Multilocus sequence typing (MLST)分子分型，獲得38個已知ST型，并發現2個新的ST型。在此基礎上，針對7個看家基因進行了系統發育分析，分離株顯示了一定的地區差異性。該試驗結果可為浙江省禽源大腸埃希菌的耐藥性評價和溯源分析提供參考依據。

大腸埃希菌；細菌耐藥性；多位點序列分型(MLST)；系統發育樹

細菌耐藥性被認為是人類和動物健康的重要威脅[1-2]。耐藥基因可以通過可移動元件(質粒、轉座子等)在不同的病原菌中轉移[3-7]。多重耐藥的革蘭陰性菌的耐藥性狀況尤其嚴峻，是重要的耐藥基因庫[8-11]。大腸埃希菌是腸桿菌科中典型的污染指標菌，其耐藥表型多樣，多重耐藥日益嚴重[12]。禽產業鏈污染大腸埃希菌溯源分析對于明確致病性大腸埃希菌的污染狀況和來源具有重要意義[10]，而以方便快速、分辨率高為特征的多位點序列分型(multilocus sequence typing， MLST)技術已經成為微生物的分子流行病學和溯源研究的重要手段[13-14]。

本試驗選擇對浙江省3個地區市售的冷鮮雞肉樣本進行大腸埃希菌分離，檢測耐藥譜并對分離株進行MLST分型分析。以進一步探明浙江省地區禽源大腸埃希菌耐藥性特點及分布規律，為浙江省禽產業鏈大腸埃希菌污染防控提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集

冷鮮雞整只雞肉樣品來源于浙江省紹興(SX)、湖州(HZ)以及金華(JH)三個地區的超市或農貿市場，分別采集了10、9和16個，采樣時間為2016年8月。大腸埃希菌質控菌株ATCC 25922為實驗室保藏，來源于美國典型培養物保藏中心(American Type Culture Collection， ATCC)。

1.1.2 主要儀器與試劑

細菌鑒定及耐藥譜分析采用梅里埃VITEK 2 Compact 全自動細菌鑒定及藥敏分析系統；細菌DNA提取試劑盒購于上海捷瑞生物工程有限公司；高保真酶PrimeSTAR購自寶生物工程(大連)有限公司；主要儀器有核酸電泳儀(上海天能科技有限公司)、凝膠成像系統Gel DocTMXR+[伯樂生命醫學產品(上海)有限公司]、ABI-Veriti梯度PCR儀(美國應用生物系統公司)等。

1.2 方法

1.2.1 大腸埃希菌分離

分離方法采用國家標準GB 4789.38—2012進行，獲得純培養物后通過全自動細菌鑒定系統進一步確認后，使用20%甘油溶液保藏于-80 ℃冰箱中。

1.2.2 基因組DNA提取

在LB平板上劃線分離單菌落，37 ℃溫度下液體培養10 h，D600在0.6至1.0之間，取500 μL收集菌體，采用上海捷瑞生物細菌基因組抽提試劑盒及操作說明提取基因組DNA，然后進一步通過瓊脂糖凝膠電泳確認質量。

1.2.3 PCR擴增

MLST擴增引物adk(adenylate kinase，腺苷酸激酶)、fumC(fumarate hydratase，延胡索酸水合酶)、gyrB(DNA gyrase，DNA解旋酶)、icd(isocitrate/isopropylmalate dehydrogenase，異檸檬酸脫氫酶)、mdh(malate dehydrogenase，蘋果酸脫氫酶)、purA(adenylosuccinate dehydrogenase，腺苷酸琥珀酸脫氫酶)和recA(recombinase A，重組酶A) 參考http://mlst.warwick.ac.uk/mlst/dbs/Ecoli/documents/primersColi_html網站中公布的序列委托上海捷瑞生物工程有限公司合成(表1)。50 μL反應體系，包含0.5 μL PrimeSTAR HS DNA 聚合酶、上下游引物(10 μmol·L-1)各1.0 μL、dNTP(2.5 mmol·L-1)4.0 μL和基因組DNA模板0.5 μL。擴增條件：98 ℃ 10 s、57 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min，35個循環。擴增完畢后，取PCR產物3 μL通過瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

1.2.4 測序及MLST分型分析

擴增的單一條帶與預計大小相符后，割膠回收后委托杭州擎科梓熙生物技術有限公司進行sanger法測序，測序的峰圖文件使用phred/phrap/consed工具包進行拼接、質量驗證。拼接獲得的保守基因部分序列使用在線工具http://mlst.warwick.ac.uk/mlst/dbs/Ecoli進行分析，獲得各看家基因的等位基因編碼(allele number)，并生成各菌株的ST序列型。

1.2.5 進化樹分析

將測得的不同等位基因序列分別通過Clustal進行對位分析，7個基因串聯后采用NJ(neighbor-joining)法進行bootstrap值為1 000次的重復構建，使用MEGA6軟件進行系統發育樹圖形繪制。

表1 本試驗所需引物

Table 1 Primer sequences used in this study

基因名稱Genename引物序列Primersequence(5'-3')退火溫度Annealingtemperature/℃adkF:ATTCTGCTTGGCGCTCCGGG54R:CCGTCAACTTTCGCGTATTTfumCF:TCACAGGTCGCCAGCGCTTC54R:GTACGCAGCGAAAAAGATTCgyrBF:TCGGCGACACGGATGACGGC60R:ATCAGGCCTTCACGCGCATCicdF:ATGGAAAGTAAAGTAGTTGTTCCGGCACA54R:GGACGCAGCAGGATCTGTTmdhF:ATGAAAGTCGCAGTCCTCGGCGCTGCTGGCGG60R:TTAACGAACTCCTGCCCCAGAGCGATATCTTTCTTpurAF:CGCGCTGATGAAAGAGATGA54R:CATACGGTAAGCCACGCAGArecAF:CGCATTCGCTTTACCCTGACC58R:TCGTCGAAATCTACGGACCGGA

1.2.6 耐藥譜測定

大腸埃希菌鑒定和藥敏試驗采用梅里埃微生物全自動藥敏系統進行檢測。

2 結果與分析

2.1 獲得菌株和耐藥譜測定

采用1.2.1節方法分離的大腸埃希菌菌株經過VITEK 2 Compact系統再次鑒定后，共計獲得59株大腸埃希菌，并同時獲得每株菌對18種抗生素的耐藥譜，共獲得24種耐藥譜(表2)。根據表2中統計，所有分離株對18種抗生素全敏感有12株；耐1種藥物有12株，其中耐磺胺藥SXT(甲氧芐啶)有7株；耐2種藥AMP(氨芐西林)和SXT的菌株共計13株，是耐藥類型中頻率最高的。另外，耐3種藥物以上共計20株，耐6種以上抗生素有10株。從以上數據可以看出分離的大腸埃希菌耐藥類型多樣，其中多重耐藥現象普遍。由圖1得知，所有的分離株中耐AMP和SXT的比例最高，分別為61%和50%；其次為CFZ(頭孢唑林)、CRO(頭孢曲松)和CIP(環丙沙星)，耐藥率都超過了20%。

抗生素代碼與表2的表注相同The antibiotic code is the same as in Table 2.圖1 大腸埃希菌分離株對18種抗生素的耐藥率Fig.1 The resistance rates of Escherichia coli to 18 kinds of antibiotics of isolates

2.2 MLST分析

7個看家基因adk、fumC、gyrB、icd、mdh、purA和recA經PCR擴增后電泳均獲清晰單一條帶(圖2)，經測序后獲得基因的部分保守序列。59組等位基因提交數據庫比對后，共計獲得38個ST型，另有2種ST型未知，應定義成新的ST型(圖3)。這說明分離的大腸埃希菌基因型具有多態性，菌株來源多樣化。其中ST-155有7株，ST-10有6株，預示著這兩個基因型的大腸埃希菌在3個地區分布較廣泛；而其他型均只有1～2株。

2.3 系統發育分析

通過將MLST分型方法使用的7個看家基因測得的序列串聯后，對59株大腸埃希菌分離株和大腸埃希菌野生型菌株MG1655進行系統發育AMP(Ampicillin，氨芐西林)、AMX(Amoxicillin，阿莫西林)、TZP(Piperacillin，哌拉西林)、CFZ(Cefazolin，頭孢唑林)、FOX(Cefoxitin，頭孢西丁)、CRO(Ceftriaxone，頭孢曲松)、FEP(Cefepime，頭孢吡肟)、ATM(Aztreonam，氨曲南)、ETP(Ertapenem，厄他培南)、IPM(Imipenem，亞胺培南)、AMK(Amikacin，阿米卡星)、GEN(Gentamicin，慶大霉素)、TOB(Tobramycin，妥布霉素)、CIP(Ciprofloxacin，環丙沙星)、LEV(Levofloxacin，左氟沙星)、TGC(Tigecycline，替加環素)、NIT(Nitrofurantoin，呋喃妥因)、SXT(Trimethoprim，甲氧芐啶)。

表2 耐藥譜統計

Table 2 Statistics of drug resistance spectrum

耐藥種數Numberofresistedantimicrobials耐藥譜Antibioticresistancespectrum耐藥菌株數Numberofantibioticresistantstrains0-121AMP41CFZ11SXT72AMP-NIT12AMP-SXT132CIP-LEV13AMP-CFZ-CRO13AMP-CFZ-NIT13AMP-CFZ-SXT13AMP-CIP-LEV13AMP-CIP-SXT13AMP-GEN-CIP14AMP-CFZ-CRO-ATM24AMP-CFZ-CRO-SXT14AMP-TOB-CIP-SXT16AMP-CFZ-CRO-FEP-ATM-SXT16AMP-CFZ-CRO-GEN-TOB-SXT27AMP-CFZ-CRO-ATM-CIP-LEV-SXT17AMP-CFZ-CRO-CIP-LEV-NIT-SXT17AMP-CFZ-CRO-IPM-CIP-NIT-SXT18AMP-CFZ-CRO-ATM-GEN-CIP-LEV-SXT18AMP-CFZ-CRO-GEN-TOB-CIP-LEV-SXT19AMP-AMX-CFZ-CRO-GEN-TOB-CIP-LEV-SXT19AMP-CFZ-CRO-ATM-GEN-TOB-CIP-LEV-SXT1

“-” 代表對抗生素全敏感。The symbol “-” represents all sensitivity to 18 antibiotics．

圖2 七個看家基因的電泳結果Fig.2 Electrophoresis results of 7 housekeeping genes

樹分析(圖3)。發現系統發育樹有兩個明顯的分支Group 1 和Group 2，bootstrap值均大于50%，說明分支穩定可信。其中JH市分離的菌株大部分存在于Group 1，少部分存在于Group 2，體現出該地區的特征差異性；HZ和SX市分離株分布沒有規律，并且兩市分離株同時聚類在Group 1和Group 2中，說明這兩個地區間沒有地區特征性差異。另外，在該系統發育樹中表現出了地區特有分支，例如JH市的ECCJH98-2、ECCJH103-2、ECCJH107-2和ECCJH111-1；SX市的 ECCSX58-2、ECCSX69-2、ECCSX56-1和ECCSX56-2。

3 結論與討論

大腸埃希菌一直是人和動物的條件致病菌，容易造成人畜共患病[15]。由于畜禽養殖中大量使用抗生素，導致大腸埃希菌多重耐藥性越來越嚴重，直接給人類和環境造成威脅[2]。大腸埃希菌中的耐藥基因通常存在于質粒上，而質粒是耐藥基因轉移的最重要的可移動元件[6，16]。分離的大腸埃希菌即使沒有致病性，但是其攜帶的多重耐藥基因質粒對腸桿菌科其他的致病菌或者其他種類病原菌存在非常大的轉移風險。冷鮮雞是禽產品產業鏈的后端環節，人群可以直接接觸，評價其污染的大腸埃希菌的耐藥性具有重要衛生意義，對該大腸埃希菌分離株進行基因分型，有助于對這些大腸埃希菌的分布規律進行研究。

黑體字體為JH市來源的分離株，淺灰色字體為SX市來源的分離株，▲+淺灰色字體為HZ市來源的分離株。The black font strains are isolates from JH city， the grey font strains are isolates from SX city and ▲+ grey font strains are isolates from HZ city．圖3 七個看家基因部分序列串聯系統發育樹Fig.3 A phylogenetic tree of partial sequences of 7 housekeeping genes

本研究從浙江省3個地區市售冷鮮雞樣品中直接分離出大腸埃希菌59株，對于評價其耐藥性具有一定的代表性。本研究檢測到了24種耐藥譜，其中耐AMP-SXT菌株較多，占22.0%。所有菌株中耐藥率最高的同樣是AMP和SXT，均超過50%，這和養殖過程中這兩種藥的大量使用相關，兩種抗生素耐藥基因是否同時存在于同一移動元件上有待進一步研究。通過對分離到的59株大腸埃希菌的7個看家基因進行測序比對，我們分別獲得了相應的38種ST型，另外還發現了2種未知類型，反映了分離株的基因型多樣性。ST-10和ST-155類型在3個地區均有檢出，說明可能污染的來源相同。針對這7個基因序列進一步做系統發育分析后，菌株被分為兩個主要的組。我們發現JH市的菌株顯示了一定的區域性，而SX和HZ的菌株大多親緣關系較近，沒有明顯的區域隔離。該結果可能與冷鮮雞上游的供應鏈有關，JH市相對于其他兩市距離遠，相對獨立，冷鮮雞來源的屠宰場不同，HZ和SX分支距離較近，供應鏈很可能存在交叉。

本試驗通過對以上菌株進行耐藥譜測定、MLST分子分型以及系統發育分析，為明確浙江省市售冷鮮雞污染的大腸埃希菌的耐藥狀況提供數據支撐。同時為其分子溯源研究提供了思路。

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(責任編輯 盧福莊)

Drug resistance spectrum analysis and MLST genotyping ofEscherichiacolifrom refrigerated chicken in three regions of Zhejiang Province

YANG Hua1，2， HE Xiangxiang1，2，3， XIAO Yingping1，2， QIAN Mingrong1，2， ZHANG Qiaoyan1， TANG Biao1，2，*

(1.InstituteofQualityandStandardforAgro-products，ZhejiangAcademyofAgriculturalSciences，Hangzhou310021，China; 2.StateKeyLaboratoryBreedingBaseforZhejiangSustainablePestandDiseaseControl，ZhejiangAcademyofAgriculturalSciences，Hangzhou310021，China; 3.CollegeofFoodScienceandEngineering，NorthwestA&FUniversity，Yangling712100，China)

Escherichiacoliis a common opportunistic pathogen in food. Its drug resistance is severe in which the related resistance genes can easily spread. In this study, 59 strains ofE.colifrom refrigerated chicken in three regions of Zhejiang Province were isolated. Using drug resistant spectrum determination, 24 types of drug resistant spectrum were found, which showed that the drug resistant types ofE.coliisolates were multifarious. Meanwhile, all theE.coliisolates were analyzed with MLST genotyping. The results showed that a total of 38 ST types were obtained, and two new ST types were found as well. On this basis, the phylogenetic analysis of 7 housekeeping genes showed a certain degree of the regional differences. This research results can provide scientific reference for the evaluation of drug resistance and traceability analysis of avianEscherichiacoliin Zhejiang province, and a wider region in China.

Escherichiacoli; bacterial drug resistance; multilocus sequence typing (MLST); phylogenetic tree

10.3969/j.issn.1004-1524.2017.06.05

2017-05-12

浙江省農業科學院青年人才培養項目(2017R19R08E01)；浙江省植物有害生物防控重點實驗室——省部共建國家重點實驗室培育基地(2011DS700124-ZZ1703)；浙江省重點研發項目(2015C02041)

楊華(1972—)，男，浙江紹興人，碩士，高級畜牧師，研究方向為畜產品質量安全。E-mail: yanghua806@hotmail.com

*通信作者，唐標，E-mail: tb_411@163.com

S852.61

A

1004-1524(2017)06-0888-06