桑樹Na+/H+逆向轉運蛋白基因的克隆及功能分析

劉 巖，計東風，沈國新，魏 佳，林天寶，朱 燕，呂志強

(浙江省農業科學院 蠶桑研究所，浙江 杭州 310021)

桑樹Na+/H+逆向轉運蛋白基因的克隆及功能分析

劉 巖，計東風，沈國新，魏 佳，林天寶，朱 燕，呂志強*

(浙江省農業科學院 蠶桑研究所，浙江 杭州 310021)

鹽害是威脅作物生長的重要因素之一，培育和種植耐鹽作物品系是進行鹽地開發利用的有效途徑。該研究通過RACE方法，從特優1#桑品種克隆獲得了Na+/H+逆向轉運蛋白基因(MaNHX)的全長cDNA(2 016 bp)，編碼蛋白預測分子量59.28 ku，等電點6.67，含保守位點(82LFFIYLLPPI91)。用根癌農桿菌介導法，將MaNHX基因導入擬南芥中，結果表明，在擬南芥中異源表達MaNHX能明顯提高擬南芥對鹽脅迫的耐受性。轉基因植株NaCl脅迫下葉綠素含量更高、抗氧化活性增強，MDA含量下降。結果證實，異源表達MaNHX轉基因擬南芥可以通過維持細胞膜穩定性、減少膜損傷和透性傷害等機制應對鹽脅迫。該研究可為桑樹的抗鹽品種培育提供候選參考基因。

Na+/H+逆向轉運蛋白基因；鹽脅迫；桑樹；轉基因

土壤鹽漬化(主要是Na+)是影響全球生態環境和農林業生產的重要問題。據統計，全球每年因鹽害造成的經濟損失超過120億美元[1]。傳統育種方法雖然在改進非生脅迫方面取得了一定成績，但礙于復雜基因座等因素的困擾，選育耐鹽品種的進展較為緩慢。近年來，隨著分子遺傳學和植物轉基因技術的快速發展，采用生物技術快速提高作物的耐鹽性方面的研究受到越來越多的關注。

土壤中高濃度的鹽會擾亂植物正常代謝活動，造成離子毒害、水分虧缺和離子失衡等損傷，進而導致植物生長受到抑制，甚至死亡[2-3]。為應對鹽脅迫，植物通過增加外排、限制吸收、液泡區隔化以及滲透調節等策略來降低胞質中的Na+，維持細胞穩定性。其中，植物Na+/H+逆向轉運蛋白基因(NHX)主要負責Na+的液泡區隔化作用。過表達AtNHX能增加擬南芥的耐鹽性[4]。目前，NHX基因已在番茄(Solanumlycopersicum)[5]、油菜(BrassicacampestrisL.)[6]、小麥(BrassicacampestrisL)[7]、水稻(OryzasativaL)[8]、楊樹(Pterocaryastenoptera)[9]等多種植物中陸續被報道，它們在植物耐鹽調控中發揮重要作用。

桑樹(Morusalba)一直以來都是家蠶的飼料，是蠶絲產業的重要物質基礎。近年來的調查發現，桑樹對鹽堿、干旱和貧瘠等逆境的適應性較強，可以作為鹽堿地綠化及防沙、治沙等生態治理的經濟樹種[10-11]。鹽害對桑樹種子萌發[12]、光合和理化[13]影響已有報道。在分子基礎研究方面，雖然邊晨凱等[14]克隆了川桑NHX1(MnNHX1)基因，并將其轉入擬南芥，發現MnNHX能提高擬南芥的耐鹽能力；但目前對桑樹生產品種中的NHX基因及其功能特性仍未見報道。為此，我們從生產品種特優1#桑樹中克隆了NHX全長基因，借助農桿菌轉入擬南芥中過表達，并進行了耐鹽性能的檢測，以期增加對桑樹防御鹽害方面的認識，進一步探明桑樹耐鹽調控機制，為耐鹽新品種的選育提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

特優1#桑樹為蠶業生產上廣泛應用的優良雜交品種，特優1#桑種子由廣西壯族自治區蠶業技術推廣總站提供。擬南芥(Col-0)為實驗室保存株系。

1.2 RNA抽提及cDNA合成

取桑特優1#新鮮葉片，參照Tranzol Plant Kit操作說明，抽提樣品總RNA，電泳檢測RNA質量，通過紫外分光光度計測定RNA濃度后，取RNA樣品500 ng，參照SuperScript II RT kit (Invitrogen，USA)配制反轉錄體系，經42 ℃逆轉錄反應60 min，獲得cDNA，保存在-20 ℃備用。

1.3 全長MaNHX的擴增

根據NCBI登錄的NHX1基因序列，經比對后設計兼并引物F1(5′-TAYAGTCTDGTDTTYGGDGARGG-3′) 和R1(5′-CKCATVAGNCCDGCCCACCA-3′)，以上述cDNA樣品為模板，擴增獲得MaNHX片段。經測序分析后，再設計合成引物GSP-F1-NHX(5′-GCATTCGTGTTCCCTCTGTCCGCTC-3′)和GSP-R1-NHX(5′-GAGAATCCCGCAGAAGAAGACGGTGAG-3′)，按Clontech公司試劑盒操作說明，分別進行3′RACE和5′RACE擴增，回收PCR產物，與pEASY-T1載體鏈接，轉化DH5α感受態細胞，挑選克隆進行測序驗證。

1.4 基因生物信息學分析

將MaNHX基因cDNA序列提交NCBI數據庫，與桑樹基因組序列進行Blast比對，分析MaNHX基因結構信息。利用ORF finder(http://www.ncbi.nlm.nih.govgorforfig.cgi)預測基因編碼框，利用在線軟件(http://isoelectric.ovh.org/)分析蛋白分子量和等電點，并通過TMHMM server v.2.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)預測分析MaNHX蛋白的二級結構。

1.5 定量PCR檢測

特優1#桑種子經10%次氯酸鈉消毒處理后，置MS培養基，于光周期14 h/10 h(L/D)、溫度22 ℃、相對濕度75%、光強度≥3 000 lx的培養箱中萌發。

在無菌培養皿中放置2層濾紙，加入含0、50、100 、200 mmol·L-1NaCl溶液至濾紙飽和并稍有余液滲出。每個平皿內放5株萌發2周的桑幼苗，每個濃度NaCl處理組設3個重復。處理后1、4、8、12、24、48 h分別取樣，檢測NHX基因的轉錄表達。轉基因擬南芥株系的MaNHX表達水平用定量PCR檢測，定量PCR反應體系參照試劑盒配制。引物F-MaNHX(5′-CCTGTTCAGTACGGTGGT-3′)和R-MaNHX(5′-GAGAATGTTGGTTGTGGC-3′)擴增MaNHX基因172 bp片段，引物F-AtNHX(5′-CTTGGGTGATTATCTTGCTATTGG-3′)和R-AtNHX(5′-GCTTCGTGGTTTAGGTGAGTGA-3′)擴增AtNHX基因195 bp片段。引物F-Maactin(5′-TTCCTATCTACGAGGGTTATGC-3′)，R-Maactin(5′-GTCAAGAGCAATGTAAGCCAAT-3′)和F-Atactin(5′-CCCTGCTATGTATGTGGCTAT)，R-Atactin(5′-GCTGTGGTGGTGAAAGAGTAA-3′)分別擴增Maactin基因179 bp和Atactin基因225 bp片段作為內參。擴增結果按照2-ΔΔCt方法進行統計分析[15]。

1.6 重組載體的構建及擬南芥轉基因

設計引物F2(5′-TGCTCGAGATGGAGATGTTGCAAGGAGTAATG-3′)、R2(5′-GGTCTAGATCACACTCCAAAAAGTGGTTGTTG-3′)擴增MaNHX全長ORF序列，產物經XhoI/XbaI雙酶切后，連入pFGC-5941載體中，經測序驗證后，轉化并篩選重組農桿菌，利用浸花方法轉化野生型擬南芥。再利用Basta抗性進行轉基因擬南芥的篩選。以陽性轉基因株系為供試分析材料，同時以野生型擬南芥Col-0和pNHX1轉基因擬南芥[4]株系為對照分析材料。

1.7 NaCl脅迫對NHX轉基因擬南芥的萌發觀察

MaNHX轉基因擬南芥(MaNHX)、pNHX1轉基因擬南芥(AtNHX1)和野生型(WT)種子經10%次氯酸鈉消毒處理后，分別置于含0、50、100、200、250 mmol·L-1的1/2 MS培養基中，于光周期14 h/10 h(L/D)、溫度22 ℃、相對濕度75%，光強度≥3 000 lx的培養箱中萌發。參照文獻[12]的方法統計萌發指標。

1.8 理化檢測方法

MaNHX轉基因和野生型擬南芥，同上條件在正常1/2 MS培養基上萌發培養2周后，將各株系幼苗分別移栽在營養土中繼續培養3周。其中，野生型和轉基因株系各36株苗，每組均隨機分成2組，每組設置3個重復，每個重復含6株植物：一組每日以水浸透土壤，另一組每日以200 mmol·L-1的NaCl溶液浸透土壤，連續處理2周后，記錄2組植物的生長狀況，并取各組葉片用于檢測分析。

葉綠素含量測定：參照文獻[16]的方法，分別取野生型植株(對照組)、轉MaNHX植株同葉位的葉片，剪成適宜大小后，分別置于95%乙醇溶液，黑暗浸泡48 h，用Tecan Infinite 200 PRO多功能酶標儀，以95%乙醇為對照，測定波長649、665 nm下的吸光值，計算葉片樣品的葉綠素a(Chla)、葉綠素b(Chlb)含量，以及單位新鮮葉片的葉綠素含量。

葉片相對含水率測定：參考文獻[17]的方法，利用稱量法測定葉片的相對含水率(relative water content，RWC)，采集的葉片測定鮮質量(fresh weight，FW)后，將葉片浸于無菌水過夜，拭干葉片表面水分后稱濕質量(wet weight，WW)，之后再將葉片70 ℃烘干，稱取干質量(dry weight，DW)。按公式RWC=(FW -DW) / (WW- DW) ×100%，計算葉片相對含水率。

丙二醛含量測定：丙二醛(MDA)含量采用試劑盒法(試劑盒購自上海紀寧實業有限公司)，按照文試劑盒說明書操作、比色、計算MDA含量。

CAT和SOD活性測定：參照文獻[16]的方法抽提蛋白液，過氧化氫存在條件下，過氧化物酶(catalase，CAT)能使愈創木酚氧化生成茶褐色物質，可利用分光光度計檢測CAT活性；超氧化物歧化酶SOD活性采用氮藍四唑光化還原法測定。

離體葉盤的NaCl脅迫檢測：參照文獻[17]的方法，將新鮮葉片打孔取樣，采集直徑0.5 cm的葉盤，分別漂浮于0、100、200、300、500 mmol·L-1NaCl溶液中3 d，檢測試驗組轉基因植株葉片在NaCl脅迫下的形態變化。

1.9 統計分析

利用Excel和SPS version 19進行數據統計分析，計算3次重復的平均值±標準誤，采用單因素方差分析方法比較差異顯著性。

2 結果與分析

2.1MaNHX基因的獲得及分析

利用兼并引物擴增獲得659 bp的MaNHX片段序列，經3′和5′RACE擴增后，得到特異性擴增產物833和947 bp條帶(圖1-A)，測序并拼接得到MaNHX的全長cDNA序列(圖1-B)。序列全長2 016 bp，含一個完整的開放閱讀框，編碼530個氨基酸；編碼蛋白分子量59.28 ku，等電點6.67。生物信息學比對發現MaNHX具有Nha P-type Na+/H+(或K+/H+)保守結構域和amiloride結合結構域(82LFFIYLLPPI91)，二級結構顯示它具有11個跨膜結構域(圖1-C)。

A，RACE擴增MaNHX的電泳檢測結果。M，DL 2 000 marker；1為兼并引物的擴增結果；2、3分別為5’RACE和3’RACE的擴增結果。B，MaNHX全長序列。方框為起始密碼子或終止密碼子，陰影部分為保守序列。C，根據TMHMM軟件預測的MaNHX跨膜結構域A， PCR amplification products of MaNHX in RACE reaction. M， DL 2 000 marker; 1， Conserved NHX fragment amplified using the degenerate primers; 2， 5’ RACE products; 3， 3’RACE products. B， Full length of MaNHX， in which the start and stop codons were indicated with a square， respectively， while the conserved motif of82LFFIYLLPPI91 was displayed in shadow. C， Transmembrane domains of MaNHX predicted by TMHMM Server v.2.0.圖1 桑樹特優1# MaNHX的全長核苷酸及其預測的氨基酸序列Fig.1 Nucleotide and deduced amino acid sequence of the MaNHX gene from mulberry You 1#

2.2MaNHX對NaCl脅迫的響應

定量PCR結果顯示：NaCl脅迫后24 h內，MaNHX的表達呈逐步上升趨勢，24 h之后下降(圖2)。隨著NaCl濃度的增加，MaNHX的表達水平也逐漸升高，表明桑樹MaNHX的表達受鹽脅迫的誘導。

對動物檢疫監督員開展定期與不定期業務培訓，提高服務能力。要教育動物檢疫員嚴格按照國家有關技術規程實施現場檢疫，使用地區統一的表格做好現場檢疫記錄，嚴格出證條件，規范出具檢疫證明，禁止只收費不檢疫、檢疫合格后不出證或不規范出證等行為。

圖2 NaCl脅迫下桑樹幼苗MaNHX的表達水平Fig.2 Relative expression of MaNHX in mulberry seedlings under salt stress

2.3 NaCl脅迫下MaNHX對轉基因擬南芥萌發性能的影響

用根癌農桿菌介導的浸花法轉化擬南芥，經過Basta抗性和定量PCR檢測篩選后，在NaCl脅迫下對MaNHX株系(MaNHX1-2、MaNHX1-4、MaNHX1-6)和AtNHX1株系(AtNHX1-2、AtNHX1-3、AtNHX1-4)進行萌發性能調查。結果顯示：正常培養條件下，轉基因擬南芥(MaNHX或AtNHX1)與野生型WT間生長無明顯差異；而在200 mmol·L-1NaCl脅迫條件下，轉基因植株表現出更強的萌發性能(圖3)。50 mmol·L-1NaCl處理組，轉基因植株根系生長較野生型更茂密，側根數量也更豐富。之后隨著NaCl濃度的繼續增加，轉基因株種子萌發率仍顯著高于野生型。其中，MaNHX轉基因株表現略優于AtNHX1轉基因株。

2.4 NaCl脅迫下MaNHX基因對轉基因擬南芥葉綠素含量的影響

野生型和MaNHX轉基因擬南芥的葉綠素含量檢測結果顯示，在正常培養條件下，MaNHX轉基因擬南芥的葉綠素水平略高于WT株系；200 mmol·L-1NaCl脅迫處理后，轉基因株、野生型植株葉片葉綠素都明顯下降，其中，轉基因株葉綠素含量下降幅度約19.9%，而野生型植株平均下降幅度為25.6%。NaCl脅迫后，轉基因株葉綠素含量是野生型的1.11倍(圖4-A)。離體實驗也顯示轉基因株系葉片在NaCl脅迫下褪色更慢(圖4-B)。這表明NaCl脅迫時，MaNHX的過量表達有助于減緩葉綠素含量的下降速度。

MaNHX轉基因株(MaNHX1-2、4、6)、AtNHX轉基因株(AtNHX1-2、3、4)和野生型擬南芥在不同濃度NaCl脅迫下，萌發14 d的調查結果The wild type (WT， col-0) and transgenic (AtNHX1-2， 3， 4 and MaNHX1-2， 4， 6 were three transgenic lines of 35S::AtNHX1 and 35S::MaNHX， respectively.) seedlings were observed for germination score after 14 days exposure to salt stress圖3 轉基因擬南芥種子在NaCl脅迫下的萌發性能比較Fig.3 Germination efficiency of transgenic Arabidopsis lines under salinity stress.

A，200 mmol·L-1 NaCl脅迫下擬南芥葉片葉綠素含量變化。B，擬南芥離體葉盤在不同濃度NaCl溶液中浸泡的顏色觀察。WT，野生型；1-3分別為轉基因株系MaNHX1-2，-4，-6的T3苗A， Chlorophyll content of Arabidopsis leaves under 200 mmol·L-1 NaCl stress. B， Phenotypic differences in the leaf discs dipped in different concentration of NaCl solution. WT， wild type; 1-3 was the T3 transgenic lines of MaNHX1-2，-4，-6， respectively圖4 NaCl脅迫處理下擬南芥葉片葉綠素含量的變化Fig.4 Chlorophyll content of Arabidopsis leaves under NaCl stress

2.5 NaCl脅迫下轉基因植株的MDA含量和抗氧化物酶活性變化

NaCl脅迫下，葉片的相對含水率降低，其中WT降低14.52%，而轉基因株系只降低了10.01%，表明轉基因株系的保水性能較野生型有明顯增強(圖5-A)。NaCl脅迫下，植株葉片MDA含量下降，但轉基因株系下降幅度較WT下降幅度小7.06%(圖5-B；兩種抗氧化物酶活性都呈現增高趨勢，其中轉基因株CAT和SOD活性分別較野生型高出1.11倍和1.45倍(圖5-C，5-D)。

數據以鮮質量計。*表示差異顯著(P<0.05)Data was detected based on fresh weight. *means significant difference at the levels of P<0.05圖5 200 mmol·L-1 NaCl脅迫對擬南芥生理指標的影響Fig.5 Physiological analysis of Arabidopsis under 200 mmol·L-1 NaCl stress

3 討論

液泡膜上的Na+/H+逆向轉運蛋白是目前研究得較為深入的植物耐鹽基因之一，它負責將Na+區隔到液泡，減少胞質中Na+濃度，避免過多的Na+對胞質酶造成傷害，干擾生理生化代謝；另一方面使植物利用NaCl作為滲透劑，減小細胞水勢，促進植物從外界吸水，從而有利于其在鹽漬化土壤中生存。目前已有超過200個編碼Na+/H+逆向轉運蛋白基因在GenBank和Pfam數據庫中注冊，涵蓋細菌、酵母、各類植物等。本研究克隆了桑樹NHX基因，其編碼蛋白具有Na+/H+和K+/H+無機離子逆向轉移蛋白的保守結構域，與擬南芥NHX1、鹽芥NHX1(ThNHX1)等相似[18]。與川桑NHX1(MnNHX1，GenBank登錄號KJ720637)[14]序列比對顯示，MaNHX與MnNHX1同源性為61%，這可能是NHX家族存在多種亞類基因，或同一亞類在不同種屬植物間的差異而致。今后可以通過進一步克隆鑒定桑樹NHX家族基因，并結合亞細胞定位、免疫組化等方法，更系統和深入地了解NHX家族(特別是同一物種)的基因功能。

鹽脅迫下植物葉片葉綠素含量不僅直接關系到植物光合同化過程，也是衡量植物耐鹽性的重要生理指標之一。葉綠素是植物進行光合作用的主要色素，其含量的穩定與植株在鹽脅迫下的耐受能力密切關聯[22]。本研究中，在同等NaCl濃度處理下，轉基因擬南芥葉片葉綠素含量較野生型高，同時離體葉片的黃化變慢，這與姜超強等[23]對AtNHX1轉基因楊樹的研究結果一致。檢測抗氧化物酶活性發現，在200 mm·mL-1NaCl處理下，轉基因擬南芥葉片SOD和CAT活性比野生型更高，可以有效地清除脅迫產生的活性氧類物質，從而降低活性氧對植物細胞的傷害，使得轉基因株系在NaCl脅迫下具有較低的MDA含量(圖5)。本研究結果與周樹峰等[24]對AtNHX1轉基因煙草的研究結果一致。He等[25]在棉花中異源表達AtNHX1，轉基因棉花的光合速率和氮同化率均比非轉基因植株高，轉基因棉花棉纖維和產量增加。過表達AtNHX1不僅增強了小麥植株的耐鹽性，也提高了小麥產量[7]。以上研究進一步表明，超表達NHX基因在遺傳改良作物抗逆等性能上具有應用前景。

綜上，桑樹NHX基因表達受鹽脅迫信號調控，在擬南芥中過量表達MaNHX能增加NaCl脅迫下擬南芥的萌發能力，提高葉綠素含量、葉片含水率以及抗氧化酶活性。該研究深化了我們對桑樹NHX的耐鹽性機理認識，并為今后的抗逆育種工作提供了候選基因資源。

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(責任編輯 侯春曉)

Cloning and functional characterization of a Na+/H+antiporter gene from mulberry

LIU Yan， JI Dongfeng， SHEN Guoxin， WEI Jia， LIN Tianbao， ZHU Yan， LYU Zhiqiang*

(InstituteofSericulture，ZhejiangAcademyofAgriculturalSciences，Hangzhou310021，China)

Salinity is a major factor that adversely affects the growth and yield of plants worldwide. PlantsNa+/H+antiporters(NHX) play significant role in adaption to salt stress by compartmentalizing excess cytosolic Na+into vacuoles and maintaining ionic equilibrium. Here we cloned an orthologous ofNHX1 gene from You1#， a popular mulberry variety used especially in Southwest China. The length ofMaNHXcDNA was 2 016 bp with a deduced molecular mass of 59.28 ku and pI 6.67. The consensus amiloride binding motif (82LFFIYLLPPI91) was observed in the third putative transmembrane domain. Heterologous expression ofMaNHXinArabidopsisenhanced plants salt tolerance， which was verified by retaining higher chlorophyll content， higher antioxidase activity， slower reudction of malondialdehyde (MDA) content in transgenic lines than those in WT plants when confronted with the NaCl stress. Consequently， our work suggested thatMaNHXwas a candidate salt tolerance determinant gene in future mulberry breeding.

Na+/H+antiporter pump; salinity stress; mulberry; transgenic.

10.3969/j.issn.1004-1524.2017.06.03

2016-08-23

家蠶基因組生物學國家重點實驗室開放課題(sklsgb2013015)；現代農業產業技術體系建設專項(蠶桑)(CARS-22-ZJ0105)；浙江省農業(畜禽)新品種選育重大科技專項(2016C02054)

劉巖(1976—)，女，河南焦作人，博士，副研究員，主要從事桑蠶分子生物學研究。E-mail: mayanly @sina.com

*通信作者，呂志強，E-mail: 13958131715@139.com

S718.46

A

1004-1524(2017)06-0874-08