高效毛細管電泳—二極管陣列檢測法測定微生物代謝產物中的植物激素含量

馬曉穎+楊鎮++宋艷雨++祝永剛+楊濤

摘要：建立同時分離測定微生物代謝產物中吲哚乙酸、赤霉素、細胞分裂素、脫離酸的毛細管電泳-二極管陣列檢測器新方法。研究檢測波長、緩沖體系、緩沖體系的pH值及濃度、分離電壓、進樣時間等因素。結果表明，在運行緩沖液75 mmol/L硼砂緩沖液（pH值為9.0）、75 mmol/L硼酸緩沖液、檢測波長218 nm、分離電壓20 kV、溫度 25 ℃的條件下，吲哚乙酸、赤霉素、細胞分裂素、脫離酸在0.1～5.0 mg/mL內呈較好的線性關系。測得微生物代謝產物中含有細胞分裂素和脫離酸，利用標準曲線獲得回歸方程測得含量為60.93、22.62 μg/mL。細胞分裂素和脫落酸遷移時間的相對偏差RSD分別為0.13%、0.126%；遷移峰面積RSD（%）分別為1.01%、1.92%，回收率分別為 90.1%～948%、95.8%～96.2%。因此，該方法適用于微生物代謝產物中植物激素的測定。

關鍵詞：高效毛細管電泳；二極管陣列檢測；植物激素；微生物代謝產物

中圖分類號： S182文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2017）08-0169-03

為了實現農業部在扎實推進的“到2020年化肥使用量零增長行動”和“到2020年農藥使用量零增長行動”，重點研發高效緩釋肥料、高效低毒低殘留農藥、生物肥料農藥等新型產品是十分必要的，而植物激素是被公認的用量少、效果好的植物生長調節劑。微生物天然代謝產物擁有來源安全、對土地環境友好等特點，在未來具有極大的發展潛力。

傳統的生物鑒定法對植物激素的測定難以滿足準確定量分析的要求，文獻報道的高效液相色譜法等雖可獲得較準確的結果，但存在操作繁瑣、靈敏度差、費用較高的缺點。毛細管電泳技術（HPCE）源自傳統電泳技術，具有微量、準確、成本低、污染少、分析時間快、自動化程度高的優點[1]。二極管陣列檢測器可以同時檢測在190～300 nm波長下樣品的出峰情況，并帶有3D效果的檢測峰形，可以更加直觀地判斷樣品的真實情況，判斷出是否為非正常樣品的出峰情況。本研究以微生物代謝產物為測定目標，利用高效毛細管-二極管陣列同時測定其中的4種植物激素，并建立了高效快速的植物激素含量測定方法。該方法簡單可靠、重復性好，不僅可用于微生物代謝產物中植物激素含量的測定，對其他樣品中的植物激素的定性、定量檢測都有一定的參考價值。

1材料與方法

1.1儀器與試劑

儀器：P/ACE MDQ 毛細管電泳儀 （美國貝克曼公司）；未涂層石英毛細管 （75 μm×57 cm，有效檢測長度48 cm）（美國貝克曼公司）；精密pH計（北京泰亞賽福科技發展有限責任公司）；高速臺式冷凍型離心機（德國Sigma公司）；超聲波清洗器（江蘇昆山市超聲儀器有限公司）；紫外分光光度計[尤尼柯（上海）儀器有限公司]；HZQ-QX 全溫振蕩器（黑龍江省哈爾濱市東聯電子技術開發有限公司）；干熱消毒箱（上海精宏實驗設備有限公司）；DOA-P504-BN 真空泵（IDEX公司）；ETS-D5 磁力攪拌器、A11 高速粉碎機（德國IKA集團）。CascadaTM實驗室超純水系統（Pall corporation）。

試劑：微生物菌種來源于遼寧省農業科學院微生物工程中心；吲哚乙酸（IAA）標樣，赤霉素（GA），細胞分裂素（6BA），脫落酸（ABA）（北京奧博星生物技術有限責任公司）；試驗過程用的試劑均為分析純和色譜純；試驗用水為超純水。

1.2試驗方法

新毛細管用甲醇沖洗3 min，1 mol/L的HCl沖洗2 min，0.1 mol/LNaOH沖洗1 min，去離子水沖洗0.5 min。活化好的毛細管使用前用0.1 mol/L的NaOH、水、電泳緩沖液分別沖洗1、2、3min；每次進樣之間，用緩沖液沖洗2 min，沖洗壓力為20 psi。所有溶液在進入毛細管前，均用0.22 μm的水系微孔濾膜過濾。

樣品處理：將發酵后的微生物用雙層紗布過濾，用蒸餾水沖洗3次后60 ℃下烘干，稱質量。然后采用高速粉碎機粉碎，用10倍體積乙醇浸提24 h，用磁力攪拌器將其混勻，超聲波振蕩1 h，真空抽濾，用以上方法再提取2次，收集3次濾液備用。將處理好的微生物代謝產物1 mg/mL用0.22 μm孔徑的有機濾膜過濾，收集續濾液加同體積的運行緩沖液作為樣品溶液。

對照品的配制：將吲哚乙酸、赤霉素、細胞分裂素、脫落酸分別配成1 mg/mL的母液，用甲醇溶解。上述溶液均用 0.22 μm 孔徑的有機濾膜過濾，超聲除氣，置于冰箱4 ℃保存。

1.3電泳條件

未涂層石英毛細管（75 μm×57 cm，有效檢測長度 48 cm）；運行緩沖液為75 mmol/L硼砂緩沖液（pH值為90）；75 mmol/L硼酸緩沖液；檢測波長218 nm；分離電壓 20 kV；溫度 25 ℃；壓力0.5 psi進樣10 s，樣品運行時間為 20 min，4種植物激素運行時間為15 min。

2結果與分析

2.1高效毛細管電泳-二極管陣列檢測法條件的優化

選用pH值為9.0的75 mmol/L硼砂沖液、75 mmol/L硼酸緩沖液作為運行緩沖及分離緩沖。壓力0.5 psi進樣10 s，并在此條件下進行波長優化及電壓優化。為選取適當的檢測波長，采用PDA檢測器對4種激素標準品溶液在波長為 190～300 nm范圍內進行掃描，發現4種植物激素具有不同的最適分離波長，但在218 nm處能夠達到同時出峰且分離效果較好，故選取此波長作為檢測波長。

在確定進樣時間方面，進行5、10、20 s進樣時間的測定，結果表明，進樣5 s峰形不完整，20 s濃度太高，連峰情況增多，故選用10 s為樣品的進樣時間。

在優化分離電壓時，比較分析15、20、30 kV 3個不同電壓下4種植物激素遷移與分離情況。發現在15 kV時，基線不好；30 kV時出峰延遲，峰形拖尾，故最終選擇20 kV作為電泳測定的運行電壓。

試驗常用磷酸鹽、硼砂等緩沖體系對4種植物激素的分離進行考察，以選取合適的緩沖體系。通過磷酸鹽緩沖液不同的pH值，確定分離樣品的最適分離pH值，通過試驗比較發現，用pH值為9.0的磷鹽溶液分離時，樣品的分離效果較好，故選擇堿性緩沖液硼砂溶液進一步進行優化。

選擇10、20、50、75 mmol/mL硼砂緩沖液對4種植物激素進行分離。結果發現，當硼砂緩沖液濃度達到75 mmol/mL時，樣品和對照品的分離效果最佳，分離度和峰形都達到了相對最好的情況，故選擇75 mmol/mL及pH值為9.0的硼砂，75 mmol/L硼酸緩沖液緩沖體系作為最終運行緩沖液。

2.2高效毛細管電泳-二極管陣列檢測法對微生物代謝產物中4種激素的測定

2.2.1定性測定根據圖1、圖2可知，微生物代謝產物指紋圖譜中含有與細胞分裂素（6-BA）和脫落酸（ABA）保留時間相同的物質，與赤霉素（GA）和吲哚乙酸（IAA）的圖譜沒有重合峰，說明微生物代謝產物中含有細胞分裂素和脫落酸，不含有吲哚乙酸和赤霉素。

2.2.2定量測定根據定性試驗的結果，對細胞分裂素和脫落酸在微生物代謝產物中的含量進行定量計算。

2.2.2.1標準曲線的建立將吲哚乙酸、赤霉素、細胞分裂素、脫落酸分別配成10 mg/mL的母液，用甲醇溶解。根據毛細管電泳中的定量計算方法，將植物激素標準品配成濃度為01、0.5、1.0、2.0、5.0 mg/mL，分別進行進樣，見圖3（由于5.0 mg/mL濃度進樣時第2、3個峰濃度較大出現連峰，因此圖譜未放到圖中）。

根據毛細管電泳中的定量計算方法，將植物激素標準品配成濃度為0.1、1.0、2.0、5.0 mg/mL，分別進行進樣，以濃度（x）為橫坐標，峰面積（y）為縱坐標建立標準曲線方程（圖 4、圖5）。

毛細管電泳儀最佳條件下，細胞分裂素電泳峰面積與濃度在0.1～5.0 mg/mL范圍內呈現良好的線性關系，回歸方程為y=715 236.440 4x-22 680，相關系數r2=0.999 23，最低檢測限（LOD）為0.14 μg/mL。脫落酸回歸方程為y=391 391.409 4x+21 489，相關系數r2=0.999 02，最低檢測限（LOD）為0.28 μg/mL。將目的峰的峰面積帶入方程，得細胞分裂素的含量為60.93 μg/mL，脫落酸含量為 22.62 μg/mL。

2.2.2.2重復性和精密性試驗取同一濃度的細胞分裂素標準樣品和脫落酸標準品連續進樣5次。測細胞分裂素遷移時間的相對偏差RSD為0.13%，遷移峰面積RSD為1.01%。脫落酸遷移時間的相對偏差RSD為0.126%，遷移峰面積RSD為1.92%。準確度驗證采用回收率法進行試驗。量取3份樣品，分別加入不同量的標準溶液進行測定，實測添加量與標準添加量之比為回收率。通過試驗，測得細胞分裂素的回收率在90.1%～94.8%（表1），脫落酸的回收率為95.8%～96.2%。

3討論

測定植物激素前該微生物代謝產物進行過玉米種子的催芽，稀釋10 000倍的效果顯著，而500倍的提取物對玉米生長起到了抑制作用，這與植物激素的作用相一致，利用高效毛細管電泳對其中的植物激素進行測定，測得其含有細胞分裂素和脫落酸。但細胞分裂素和脫落酸在植物體內的作用機理尚不明確，產生的植物促生長是聯合作用還是有某一單獨成分起作用還有待深入研究。

傳統的生物鑒定法對植物激素的測定難以滿足準確定量分析的要求，文獻報道的高效液相色譜法等雖可獲得較準確的結果，但存在操作繁瑣、靈敏度差、費用較高的缺點。毛細管電泳技術（HPCE）源自傳統電泳技術，具有微量、準確、成本低、污染少、分析時間快、自動化程度高的優點。本研究以人參內生真菌菌絲為測定目標，利用高效毛細管法來測定其中的植物激素，通過不同種、不同pH值緩沖液、不同分離電壓及不同進樣時間等條件優化后，確定了本試驗的電泳條件，在建立分離效果較好的真菌代謝產物的指紋圖譜的同時，也將各種激素的出峰時間控制在15 min以內，節省了工作時間和成本，可以實現替代高效液相法測定植物激素，避免有機溶劑對人和環境的傷害，為植物激素的測定方法提供了一定的參考價值。

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